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题目：中草药提取有效成分及抑菌试验的实验方案顾建凯，李威，宗凯，唐勇，吴杰（生物技术0901）一、问题的提出西药抗生素的抗菌作用不容置疑，但其毒副作用、所引起的过敏反应、二重感染及细菌的耐药性等使其应用受到一定限制;单味中药抗菌谱一般较窄，其效用难以适应复杂而多变的病情;中药复方制剂因含多种有效成分，具有多方位的综合效用，抗菌谱广，且高效、低毒、不易产生耐药性等特点与优势，日渐受到学者们的重视。我小组想通过单味中药与中药复方制剂抑菌效果的对比，来验证中药复方的效果。二、实验假设与理论依据中医复方的抗菌作用所以优于单味药，主要在于通过配伍发挥了药物间的相辅相成作用，从而明显增强复方的抗菌效能。三、实验目标1.了解中药的抑菌作用2.学习中药有效成分的提取方法3.验证中药复方制剂的抑菌效果优于单味中药;四、实验对象、方法及手段1.实验对象实验室中老师所准备的各种微生物2.实验方法目前中药包括复方制剂杭菌作用的测定方法大部分是沿用抗菌素的研究方法，主要分为体外抗菌作用和体内抗菌作用两个方面。体外抗菌作用的测定方法又分为三类:一是连续稀释法，包括肉汤连续稀释法即试管两倍稀释法，肉汤琼脂斜面连续稀释法，肉汤琼脂平板连续稀释法;二是扩散法，包括纸片法，小杯法、打孔法等;三是熏蒸法，因其只限于挥发性物质抗菌作用研究，所以在复方制剂抗菌研究中很少使用。体内抗菌作用的测定多用动物实验性感染治疗模型，该模型均系注射大量细菌引起暴发型感染如小鼠致死性感染，家兔腹膜炎等。五、实验内容（实验步骤）1.中草药提取液的制备。将各中草药烘干、粉碎，用35%的酒精于50℃萃取48h，将提取液离心后，减压浓缩．用35%酒精定容，使最终质量浓度为1g/ml。置于0-4℃冰箱中，备用；2.培养基制备。○1按改良液体马丁培养基常规制备方法配制，用于测定中药MIC值的培养基加入微量酚红(0001%)。○2牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基（配制方法见微生物学书后）3.菌悬液的配置。将供试菌种移接入相应的斜面培养基上．细菌置于36-37℃恒温培养箱中培养24h，酵母菌置于28℃恒温培养箱中培养48h，挑选单个菌落接种于5mL改良马丁培养基内，37℃培养16-18h使菌液浓度相当于lx108个/mL。用生理盐水稀释500倍、1000倍和10000倍，使稀释后的菌液浓度约为2x105个mL、1x105个/mL和104个/mL4.纸片扩散法（以前做过的实验）5.抑菌率的测定。将中草药提取液稀释至质量浓度为0.1g/ml，待用。将固休培养基加热至熔化，待冷却至50℃时，每加20ml固体培养基加人预定量的中草药提取液（0.5、1.5ml），再加入0.2mL104个/mL的菌液（稀释后菌液浓度为103个/ml），混合均匀，先倒入无菌培养皿中，每处理3次重复，另用35%的酒精作为对照。上述操作在超净工作台内进行。将做好的细菌平板放入37℃的恒温箱中培养48h，将酵母菌平板放入28℃的恒温培养箱中培养48h后，统计菌落个数，计算抑菌率。抑菌率=（对照菌落数一处理菌落数）／对照菌落数×100%。6.中草药提取液定量杀菌试验。试验时，茵悬液浓度为104个/ml，将中草药提取液稀释至质量浓度为0.1g/ml。取0.5ml菌悬液与4.5ml稀释后的提取液混匀（对照组35%的酒精）。作用至预定时间（5、15min）后，取0.2ml菌药混合液接种于培养皿中，用涂布器涂布均匀，各处理3次重复：将做好的细菌平板放入37℃恒温箱中培养36h，将酵母菌平板放入28℃的恒温培养箱中培养48h，统计菌落个数，计算杀菌率。杀菌率=（对照菌落数—处理菌落数)／对照菌落数×100%。7.MIC值测定。用试管两倍稀释法测定中草药提取液对供试菌种的MIC。取无菌试管12支，于第1管中加入1.0mL浓度为2x105个/mL的菌液，在2～10管中每管加入1.0mL浓度为1×105个/mL菌液，在第1管内加入中药浓缩液1.0mL充分混匀后取1.0mL放入第2管，混匀后再取1.0mL放入第3管，第1管内的药物浓度为原液的1/2，第2管为第1管的1/2，其余类推，直至第10管，每种药物第11管作阳性对照(仅加菌液不加中药，培养后细菌生长，利用葡萄糖可产酸，使含酚红培养液颜色变黄)，第12管作阴性对照(仅加中药不加菌液，培养后颜色仍为红色)，试验重复两次，结果取其平均值，以能抑制细菌生长(培养后仍为红色)的最小药物浓度为其MIC。单方抗菌药MIC的测定，按普通试管二倍稀释法进行。六、实验效果及其分析摆事实，讲道理，对研究内容进行分析。这块是结题报告的主体部分，应按原来设计的内容，分几个部分把自己已做的工作加以描述分析出来。这些事情做后得到什么启发，得出什么规律性的东西，可以有数据分析、案例分析等。效果的分析最好是对比分析，通过前测、中测、后测得到三组数据，最能反映表面出成效。也可以通过具体案例的描述看出效果，如某个学生行为的变化，研究之前什么样的行为，通过一年的干预发生了怎样的变化，把他们的行为描述出来。八、问题与建议