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网址：页，共15页环孢素A及雷公藤内酯醇对CD4＋T细胞、角质形成细胞和HeLa细胞增殖的影响环孢素A及雷公藤内酯醇对CD4＋T细胞、角质形成细胞和HeLa细胞增殖的影响中华皮肤科杂志1999年第2期第32卷论著作者：李新宇郑家润徐兰芳高纪伟单位：210042南京，中国医学科学院中国协和医科大学皮肤病研究所研究所；本文所用缩写：CyA：环孢素A，PBMC：外周血单一核细胞，HeLa细胞：人子宫颈鳞状上皮癌细胞，T0：雷公藤内酯醇关键词：银屑病；CD4阳性T淋巴细胞；角蛋白细胞；雷公藤内酯；环孢菌素【摘要】目的比较环孢素A(CyA)和雷公藤提取物T0对CD4＋T细胞、角质形成细胞和HeLa细胞增殖的影响。方法采用人外周血单一核细胞(PBMC)、人表皮角质形成细胞和HeLa细胞培养，3H-TdR掺入法测定药物对细胞DNA合成的影响。结果T0和CyA都能抑制ConA诱导的人外周血T淋巴细胞增殖。T0在体外可抑制生长于低钙无血清角质形成细胞培养基中的正常人角质形成细胞和HeLa细胞株的生长，而CyA在药理浓度下无抑制作用。结论T0与CyA均能抑制T细胞增殖，但对上皮细胞的作用不同。EffectsofAnti-psoriaticAgentsonProliferationofCD4＋TCells,HeLaCellsandKeratinocytesLIXinyu,ZHENGJiarun,XULanfang,etal.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042【Abstract】ObjectiveTocomparetheanti－proliferativeactionofthecompoundT0extractedfromTripterygiumwilfordii,atraditionalChineseherb,andknowneffectivedrugcyclosporinA(CyA)onhumanTlymphocytes(Tcells)，keratinocytesandHeLacells.MethodsHumanPBMC,keratinocytesandHeLacellswereculturedinRPMI1640mediumandserum-freekeratinocytemedium,respectively.3H-TdRincorporationwasemployedtoassaytheeffectsofthesedrugsonDNAsynthesisofthecells.ResultsBothT0andCyAwerecapableofinhibitingConA-inducedproliferationofTcells.ToinhibitedthegrowthofkeratinocytesandHeLacellsinvitro,butCyAdidnot.ConclusionBothT0andCyAinhibittheproliferationofTcells,buttheiractiononepithelialcellsisquitedifferent.【Keywords】PsoriasisCD4-positiveT-lymphocytesKeratinocytesTriptolideCyclosporine网址：页，共15页银屑病免疫发病机理概念认为，该病是多基因遗传背景下T细胞失常的免疫性疾病，CD4＋T细胞是发病的关键细胞,角质形成细胞是疾病发生过程中病变集中表现的细胞。我们比较了环孢素A(CyA)与临床上治疗银屑病有效但作用原理尚不明确的天然药物雷公藤(以其提取物T0为试验药)对CD4＋T细胞、角质形成细胞和人子宫颈鳞状上皮癌细胞(HeLa细胞)增殖的影响，为抗银屑病药物作用靶位及药效学方法的研究提供依据。材料与方法一、材料1.细胞:人外周血单一核细胞(PBMC)取自健康志愿者周围血，用Ficoll液分离制备。人表皮角质形成细胞取自外科门诊正常人包皮环切手术切除的标本，自行分离制备。HeLa细胞(中国科学院上海细胞生物细胞库)。2.培养基:RPMI1640培养基，低钙角质形成细胞无血清培养基(Gibco/Brl)。3.药物:CyA(杭州中美华东制药有限公司)。蒽林和雷公藤内酯醇(T0，本所药物研究室)。鬼臼毒素(北京协和医院皮肤科王宝玺副教授惠赠)。4.仪器：LS－6500β－闪烁计数器(Beckman)。二、方法1.药物对ConA诱导的人T淋巴细胞增殖的抑制试验：人PBMC用RPMI1640完全培养基制成107/mL悬液，加ConA使终浓度为5μg/mL。分种于96孔培养板，每孔0.1mL。按设定浓度加药，每孔0.1mL。37℃，5％CO2中培养72h，终止前6h每孔加入3H－TdR18.5kBq。收集细胞，在β－闪烁计数器上测c/min值，以增殖百分率与对数浓度作图示量－效关系。2.药物对正常人角质形成细胞增殖的抑制试验：包皮标本剪成条状，以25％分散酶液处理，置4℃、16h。再置4℃、0.125％胰蛋白酶中45min。游离角质形成细胞后用角质形成细胞无血清培养基调整成5×105/mL悬液，接种于铺有Ⅲ型酸性可溶性胶原的96孔培养板中，每孔0.2mL，37℃、5％CO2中培养，每隔2d换液。第9d按设定浓度加药，每孔0.1mL。培养24h后每孔加3H－TdR18.5kBq。随后同以上淋巴细胞试验方法处理。3.药物对HeLa细胞增殖的抑制试验：传代生长3d的HeLa细胞，0.3％胰蛋白酶消化，用RPMI1640完全培养基调整为2×105/mL悬液，分种于96孔培养板，每孔0.1mL。按设定浓度加药。37℃，5％CO2中培养24h，每孔加3H－TdR18.5kBq，同以上试验处理。4.统计学处理：淋巴细胞和HeLa细胞增殖抑制试验结果用直线回归方程作相关系数的显著性检验，并计算药物抑制细胞增殖50％时的药物浓度，即IC50值。角质形成细胞增殖抑制试验结果因药物浓度点较少，未作直线方程处理，得目测IC50近似值。结果1.表1结果显示，T0及CyA在药理浓度下均显著抑制人PBMC的增殖，其IC50值分别为7.27×10－7μg/mL和4.59×10－3μg/mL,表明T0及CyA均为T淋巴细胞增殖的强抑制剂。直线回归方程：T0：Y=－21.1333网址：页，共15页－11.5878x,r=－0.9712,n=10,P＜0.01。CyA：Y=17.666－13.8333x,r=－0.9924,n=8,P＜0.01。表1T0和CyA诱导的外周血单一核细胞增值的抑制作用样品药物浓度(μg/mL)平均每分钟计数(±s,c/min)增值百分率(%)T010-102698±90410610-92062±48110-81931±1327610-7网址：页，共15页1497±735810-61124±1644410-5652±62510-4414±451610-3215±85810-2185±187网址：页，共15页10-1143±55无药对照-2538±20100CyA10-67162±19510210-55340±459110-44969±827110-3网址：页，共15页3726±435310-22895±104110-12498±833611575±122210202±32无药对照-6998±744100网址：页，共15页注：上述数据已减去本底．增殖百分率＝药物处理组/无药物处理组×100%2.表2结果显示，T0及对照药蒽林和细胞抑制剂鬼臼毒素在体外均能抑制生长于低钙角质形成细胞无血清培养基中的角质形成细胞增殖，目测IC50近似值分别为2×10－3μg/mL、7×100μg/mL和6×10－2μg/mL。而CyA在药理浓度下无抑制作用，仅在10μg/mL浓度组有26％的抑制作用。表2T0和CyA及对照药鬼臼毒素和蒽林在低钙角质形成细胞无血清培养基中对正常人角质形成细胞的抑制作用样品药物浓度(μg/mL)平均每分钟计数(±s,c/min)增值百分率(%)T010-47841±560＊＊6710-35968±656＊＊5110-24330±229＊＊37网址：页，共15页10-13393±169＊＊29鬼臼毒素10-39128±13237810-26553±1452＊＊5610-15266±417＊＊45无药对照-11703±447100蒽林1网址：页，共15页7371±67287103050±45＊＊36CyA10-18388±5229917625±45996106270±270＊＊74无药对照-8473±351100网址：页，共15页注：上述数据已减去本底＊P＜0.05．＊＊P＜0.01．增殖百分率＝药物处理组/无药物处理组×100%3.表3结果显示，T0和鬼臼毒素能抑制生长加速的上皮细胞HeLa细胞的增殖，其IC50值分别为4.59×10－5μg/mL和6.1×10－3μg/mL，前者效价较后者高133倍。而CyA在超出药理浓度下也未表现出对上皮细胞增殖的抑制作用。直线回归方程：T0：Y=－6.8571－13.1071x,r=－0.9672,n=7,P＜0.01。鬼臼毒素：Y=0.26－22.45x,r=－0.9401,n=5,P＜0.01。讨论研究结果显示，T0和CyA都具备抑制T淋巴细胞增殖及DNA合成的药效，与文献报道一致，这是两药的共同点。在治疗银屑病时，本药效能降低，CD4＋T细胞异常激活，从而下调细胞因子表达。表3T0及CyA及对照药鬼臼毒素对HeLa细胞增值的抑制作用样品药物浓度(μg/mL)平均每分钟计数(±s,c/min)增值百分率(%)T010-732556±16757810-629029±21387010-5网址：页，共15页26622±331966410-424618±41465910-312910±20453110-24377±7161110-12387±5076无药对照-41767±2210100网址：页，共15页鬼臼毒素10-423618±15378410-319243±10736810-218337±5366510-12140±90081572±4282无药对照-网址：页，共15页28267±6034100CyA10-635427±36629910-534162±44269610-437417±160910510-337116±495110410-237316±196105网址：页，共15页10-134208±282696139462±49061101032081±377790无药对照-35618±2761100注：上述数据已减去本底．增殖百分率＝药物处理组/无药物处理组×100%T0对上皮细胞增殖有直接抑制作用，而CyA在药理浓度下未表现出抑制作用。结合文献资料可推断，CyA对银屑病的药效主要不是对角质形成细胞的直接抑制作用，而是针对CD4＋T细胞及有关细胞因子，这是两药抗银屑病的主要区别。同时亦提示CyA局部应用无效的主要原因可能不是药剂学问题，而是药效学决定的。比较T0对淋巴细胞(IC50=7.27×10－7μg/mL)和上皮细胞(角质形成细胞IC50≈2×10－3μg/mL,HeLa:IC50=4.59×10－5μg/ml)的作用效价可看出，在体外，T0对T淋巴细胞的作用要比对上皮细胞的作用强得多，提示利用药物