2-DNA的复制、损伤与修复 f

Replicationanddamagerepair第二章DNA的复制、损伤和修复第一节DNA的复制(Replication,DNAbiosynthesis)指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程。哺乳动物的细胞周期（一）半保留复制DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。一、DNA复制特征DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心.半保留复制证据（以原核生物大肠杆菌为例）原料：dNTP，Mg++双链DNA模板引物（primer），常是RNA，有游离的3’OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物解螺旋酶(helicase),DnaB,由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（OriC）上解开双螺旋。与复制有关的酶和因子复制的起始点与方向亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动复制叉亲代DNA分子3’5’3’5’复制起始点（ori）：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列真核：多个起始点oriE.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键序列：13bp的序列和9bp序列,它是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。13bp序列区，每一个顺序都由GATC开始，富含A和T，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特异结合，当dnaA蛋白（约20种）结合于ori的4个部位上时复制开始。dnaA蛋白（一种专一的蛋白）和ori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaA蛋白与启动解链有关,dnaA蛋白是起始的关键成分。大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子(replicon)，每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。每个起始点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。（二）复制子一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细胞周期只复制一次(真核)。原核生物染色体和质粒都是独立（只有单一个）复制子；真核细胞染色体中有多个复制子组成。DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制.但在低等生物中,也可进行单向复制（如滚环复制）①.原核细胞：染色体和质粒固定起点双向复制，②.真核生物：染色体DNA，复制时多个起始点。（三）复制方向复制方向DNA合成的方向单向、双向？1个起始点双向复制oriori复制子oriori真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段以起始点为中心，向两个方向进行复制多个起始点二、DNA复制的酶学1.模板：解开成单链的DNA母链3.DNA聚合酶，DNA-pol2.底物dNTP：dATP，dGTP，dCTP，dTTP4.引物（primer）：RNA引物5.其他酶和蛋白质因子解链相关酶类1.解旋酶(helicase)2.拓扑异构酶（topoisomeraseI、II）3.单链DNA结合蛋白(SSB)DNA解旋酶(helicase)（解链酶）功能：DNA的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，需2分子ATP，作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。I、II、III中任一种沿模板5'-3'方向移动，rep蛋白沿模板3'-5'方向移动。5′3′5′3′rep拓扑异构酶（Topo）DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺旋DNA双螺旋拓扑异构酶首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶Ⅰ来完成，但它对正超螺旋无作用。Ⅰ型拓扑异构酶由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组中均发挥重要作用。Ⅱ型拓扑异构酶拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱类拓扑异构酶II抑制剂：依托泊苷，多柔比星，阿霉素类等单链DNA结合蛋白（SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解SSBDNA聚合酶（DNA-pol）即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）真核生物有多种：DNA-pol、、、、…原核生物有3种：DNA-polⅠ、Ⅱ、ⅢDNA聚合酶功能5´3´聚合作用5´3´外切酶3´5´外切酶活性大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率主要功能活性（nt/min）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（复合物）109，000400+++1校读,修复1000120，00040++-0.05400，00010-20+++50复制100000特性不清填补缺口50引物酶(Primase)和引发体5´5´催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶DNA合成需在RNA引物的基础上进行5´3´5´3´DnaA引发体（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解螺旋酶小结主要成员主要作用DnaA识别复制起始位点解螺旋酶解开DNA双链SSB维持已解开单链DNA的稳定引物酶合成RNA引物TOPO使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰DNA-polⅢDNA复制DNA-polⅠ水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接三、复制的化学反应生成磷酸二酯键N1OH35+dN2TPN1N2-OH35+PPiDNApol3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’第三节DNA生物合成过程1.复制的起始2.链的延长3.复制的终止一复制的起始(一)DNA解成单链由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉倒Y(二)引发体的生成解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解旋酶（三）RNA引物的合成5´5´5´3´5´3´参与复制起始的蛋白因子名称功能DnaA蛋白辨认起始点解螺旋酶（DnaB，Rep）解开DNA双链DnaC协助解螺旋酶引物酶（DnaG）催化RNA引物生成SSB稳定解开的单链拓扑异构酶理顺DNA链OriCE.coli复制起始点领头链的合成引物合成后，由DNApolⅢ（在真核细胞为DNA聚合酶和)催化，按碱基配对原则，将dNTP逐一添加到引物3’末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长二复制的延长3’——AAGACCTATT——5’5’——TTCTGGATAA——3’DNAPolI,IIandIII5’-DNA-OH5’-DNA-O-P-N-OHPP++dNTPs前导链后随链3’5’3’5’延长5’5’5’3’3’5’3’3’5’SSBDNAPolymerase冈崎片断RNA引物引物酶5’3’5’TOPOⅡ解旋酶复制过程简图半不连续复制(semi-discontinuousreplication)领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。3535解链方向领头链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶•随从链上不连续性片段的连接三复制的终止原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriterE.coli8232oriterSV40500第四节、真核生物DNA生物合成（一）DNA的复制只发生在S期（二）多复制子（三）真核细胞含有5种DNA聚合酶（四）端粒复制染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。需要引物DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供3’OH末端作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。双向复制DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。半不连续复制（semidiscontinuousreplication）由于DNA聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3’→5’。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。定义：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3’→5’方向的母链作为模板指导新的链以5’→3’方向连续合成;另一股以5’→3’为方向的母链则指导新合成的链以5’→3’方向合成1000—2000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段）。这种复制方式称之为半不连续复制。PPPOH+OHPPPOHPPPPPPOHOH+PDNA合成方向不可能是3′→5′的解释5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’前导链随从链岗崎片段半不连续复制以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(laggingstrand)。前导链：在引物的3’端按5’→3’方向连续不断地合成的DNA链。随从链：在引物的3’端按5’→3’方向不连续合成的DNA链。冈崎片段：随从链上不连续合成的DNA短片段（不包括引物）由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。DNA聚合酶（DNApolymerase）聚合酶III——主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3’OH以3’,5’磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是5’3’有从3’——5’外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸聚合酶I用于切除引物RNA,并填补留下的空隙有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶的活性；有从3’——5’外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸；有从5’——3’外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II活性弱,作用与聚合酶III相似有从5’——3’延伸多核苷酸链的聚合酶活性；有从3’——5’外切酶的活性323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段