B_02 水体中大肠菌群的测定

CentralLaboratoryofBiology水体中大肠菌群的测定微生物学实验CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【课前预习】1.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？2.食品中大肠菌群数测定的意义是什么？CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【目的要求】1.学习和掌握大肠菌群的测定方法（多管发酵法）2.了解测定过程中每一步的反应原理。3.了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【实验原理】•大肠菌群是一群能在37℃培养48h内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。•大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是否被人、畜粪便污染的标志。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法(此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵、平板分离和复发酵3个检测步骤，最后根据结果查最大自然数（mostprobablenumber）表，算出食品中的大肠菌群数。)CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity1)初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖培养基，视所加的水样体积和培养基体积而定），经37ºC培养24h，观察产酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity•发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity2）平皿分离（证实试验）•水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。•将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37ºC培养24h，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity•平板培养基使用伊红美蓝琼脂（eosinmethyleneblueagar，EMBagar）。伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）阳性菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity3）复发酵试验(完成实验）•将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37ºC培养24h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。•产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；•根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity1.被检样品根据不同需要选择检检样品（如自来水、湖水等）2.培养基乳糖胆盐发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖发酵培养基3.试剂革兰氏染色液，芽孢染色液4.其它显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，试管，刻度吸管，涂布器【实验材料】CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【操作步骤】1．水样的采取（青山湖水，应取距水面10-15cm的深层水样，用灭菌带玻璃塞的瓶子，瓶口向下侵入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水既流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出）CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity2．湖水的检查（1）初（步）发酵实验水样的稀释：10-2、10-3、10-4（用无菌水稀释）接种：取0.5ml上三个稀释度的水样接入装有4.5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（水样的体积和培养液的体积由试管而定），混匀后，37℃培养24h。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity•水样接种于发酵管内，37℃下培养：•（1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果；•（2）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气，此时应视为可疑结果。•以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。•（3）48h后仍不产气的为阴性结果。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity（2）平板分离将经24h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃培养18～24h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity（3）复发酵试验将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发酵试验(利用乳糖蛋白胨培养液)。仍为产酸产气者为大肠杆菌阳性。（4）结果计算：根据三个稀释度中阳性管数组成一个数量指标，查MPN计数表10-1CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity10ml×1001ml×1001ml×10-11ml×10-23×1×1×1×1支各3支CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【实验结果】1.将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方式报告结果。2.对样品大肠菌落数作出是否符合卫生要求的结论。CentralLaboratoryofBiologyCollegeofLifeSciences,HubeiNormalUniversity【思考题】1.在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为什么要进行复发酵试验？2.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？3.食品中大肠菌群数测定的意义是什么？生物学实验教学中心