第六讲-基因克隆的质粒载体

第六讲基因克隆的质粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所2005年8月基因克隆的质粒载体一、导言1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。2．质粒的类型多种多样F质粒：F因子或性质粒(Sexplasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(Ffactor)一道转移到原先不存在该质粒的寄主受体细胞中去。R质粒：通称抗药性因子(Resistantfactor,Rfactor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞中去。Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。3．质粒载体70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。二、质粒的一般特性1．质粒DNA(细菌质粒定义)*1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killerplasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。*2.质粒DNA分子大小文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；大的可达105KD，两者相差上百倍。1Kb～200Kb(Sambroketal.)5Kb～400Kb(Lehninger)MD(megadaltons)=106D(兆道尔顿)1.5Kb≈1MD*3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。*4.质粒DNA的分子构型SC构型：即共价闭合环形的cccDNA所呈现的超螺旋构型。走在凝胶的最前面。OC构型：即开环DNA(ocDNA)所呈现的构型，其中一条DNA链保持完整的环形结构，另一条链上则出现有一个至数个的缺口。走在凝胶的最后方部位。L构型：发生双链断裂形成的线性DNA分子所呈现的构型，通称L型。走在凝胶中间部位。2．质粒克隆载体必须具备的条件(三种共同的组成部分)①具有复制区或复制因子(replicator)复制因子：是指一段特定的质粒DNA，它含有质粒DNA的复制起点(ori)(originofreplication)，以及编码质粒DNA和质粒复制所需要的DNA序列结构。*注意复制因子(replicator)和复制子(replicon)之间在概念上的差别。复制子(replicon)：系指含有一个复制起始位点的DNA复制单位，例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行自主复制的遗传单元均称为复制子。*在一般的情况下，一个质粒只含有一个复制起点，构成一个独立的复制子。但在少数的情况下，由融合产生的质粒也会含有两个复制子，但其中只有一个有活性。②具有抗菌素抗性基因一种理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状作为选择记号，而且在有关的限制酶识别位点上插入外源DNA片段之后形成的重组质粒，至少仍要保留一个强选择记号。③具有若干限制酶单一识别位点这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的需要，而且在其中插入适当大小的外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。④具有较小的分子量和较高的拷贝数这类质粒的优点在于：a.低分子量质粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后(一般不超过15Kb)仍可有效地转化给受体细胞；b.含有较高的拷贝数有利于质粒DNA的制备，增加克隆DNA片段(基因)的产量；c.低分子量的质粒分子中对某种限制酶具多重识别位点的机率也就相应下降；3．质粒DNA编码的表型①质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%。②质粒DNA尽管分子量小，但却编码着重要的遗传性状：a.抗性特征：抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。b.代谢特征：抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物(例如乳糖、蔗糖等)的新陈代谢；复杂碳水化合物(甲苯、苯胺)及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……固N作用；H2S的合成；柠檬酸的利用；欧文氏菌的色素形成；产碱杆菌的反硝化活性；产碱杆菌和欧文氏菌的硫氨素的合成；c.修饰寄主生活方式的因子：大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；炭疽杆菌外毒素的合成；苏芸金芽孢杆菌-内毒素的合成；破伤风杆菌神经毒素的合成；大肠杆菌定居抗原的合成；大肠杆菌及链球菌等的溶血素的合成；肠道细菌的血清抗性；耶尔森菌的毒力；炭疽芽孢杆菌的荚膜的合成；大肠杆菌中铁的运转。d.其它特征：盐杆菌细胞中气泡的形成；链霉菌之痘疱形成的(致死接合)；肺炎克氏杆菌中的Kik+IncN质粒的致死效应；土壤杆菌对细菌素的敏感性；麻风杆菌之半透明/不透明菌落的变异；Nod+Flx+豌豆根瘤菌的根际蛋白质的合成；Caedibacter包涵体的产生；葡萄球菌之内肽酶活性。4．质粒DNA的转移①接合型质粒和非接合型质粒*接合型质粒(conjugativeplasmid)：又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合型质粒(non-conjugativeplasmid)：亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。加上大肠杆菌素基因——大肠杆菌Col质粒非接合型质粒加上抗菌素抗性基因——大肠杆菌R质粒，也称R因子。带上一段寄主染色体DNA——F因子接合型质粒(F因子)加上大肠杆菌素基因——大肠杆菌素Col质粒加上抗菌素抗性基因——大肠杆菌R质粒，R因子②接合型质粒F因子是最有代表性的接合型质粒：F因子在寄主菌中的三种存在方式：a.染色体外双链环形DNA，F+细胞b.染色体外双链环形DNAF细胞+寄主染色体DNA片段c.以线性DNA形式整合到Hfr细胞寄主染色体DNA上。接合型质粒F因子的接合转移：F+细胞和F-细胞，以及性须pilus结构↓F+细胞和F-细胞混合培养，通过性须作用，细胞配对，这个过程称细菌的接合作用(conjcogation)↓在细胞配对期间，F+细胞中的F因子接滚环复制模型，经过性须通道进入F-细胞(单链)↓F-细胞变成F+细胞质粒的接合转移与基因工程的安全载体问题：从基因工程的安全性角度考虑，我们感兴趣的主要是非接合型质粒：理由是：①接合型质不但自身转移；②还可引起寄主染色体片段转移；③而如果F因子整合到寄主染色体上，则会牵动染色体发生高频转移；④引起其它非接合型质粒发生迁移作用。5．质粒DNA的迁移作用(mobilization)①质粒DNA迁移作用的概念由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程叫做质粒DNA的迁移作用。非接合型质粒由于分子量小不足以编码转移过程所需的全部基因，因而不能够发生自身转移，但如果寄主细胞中存在着共存着一种接合型质粒，那么它们通常也就可以被转移。②质粒DNA迁移作用原理ColE1质粒是一种可迁移的非接合型质粒ColE1质粒迁移的生化过程：迁移条件bom位点，(位于ColE1质粒分子上)mob基因编码的核酸酶，又叫迁移蛋白*1.bom位点又叫nic位点，迁移蛋白作用于nic位点，从而引动非接合型质粒发生迁移作用。mobgene=接合性动员基因conjugativemobilizationgene.nicsite=自我转移的接合型质粒在起始接合性DNA转移时，在转移起点oriT进行链特异性及以部位特异性的单链切割的DNA部位。*2.许多质粒载体在构建过程中已失去了nic位点，故此不能被迁移。种nic-质粒的转移途径是形成融合质粒，从而使它们在形体上变成接合型质粒的一部分。*3.重组缺陷(recA)寄主菌株的使用在重组缺陷的寄主菌株中，nic-质粒就不会同接合型质粒发生重组，因此在recA寄主中，nic-质粒比nic质粒较为稳定。*4.图4-5解释6．质粒DNA的复制类型①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的(stringentplasmid)高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的(relaxedplasmid)②质粒拷贝数定义：在文献中常用有两种定义A．常用定义：生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子数。B．特殊定度：培养在富裕培养基中快速生长的细菌细胞，可拥有3-4条染色体DNA，而在碳源供应不足的培养基中缓慢生长的细菌细胞，平均只有1.1条染色体DNA。因此有的文献中质粒拷贝数定义是：每个细菌细胞中每条染色体平均具有的质粒DNA分子数。C．本书定义：在LB液体培养基中生长的每个细胞中含有高于20个以上质粒DNA者，叫做高拷贝质粒(High-copy-numberplasmids)；低于20个的则称为低拷贝质粒(low-copy-numberplasmids)。7．质粒的不亲和性问题(incompatibility)不亲和性，即不相容性①定义：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。②注意：只有当有确切的证据表明第二种B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。③不亲和群的概念：彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibilitygroup)。彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近。④质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：*1负反馈调节环(negetivefeed-backloop)大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。在质粒拷贝数少的情况下，细胞中阻遏蛋白质亦相对降低，于是阻遏蛋白质与质粒DNA中靶序列相互作用，使之发生复制。随着质粒DNA复制的结果，质粒拷贝数上升，于是所编码产生的阻遏蛋白质也就随之增多。细胞中阻遏蛋白质浓度增多的结果，会形成二聚体，于是失去与质粒DNA结合并促使其发生复制的能力。结果质粒复制停止，也就是说质粒拷贝数是受阻遏蛋白质的负反馈调节：负反馈调节环(negetivefeed-backloop)当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。*2.同一个细胞含两种相容质粒由于这两种相容质粒亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。于是这两种相容的质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。*3.同一细胞含两种不相容的质粒鉴于这不相容的质粒亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒DNA复制，还会彼此影响对方质粒DNA的复制。这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。↓质粒拷贝数控制体系无法辨别这两种不相容性质粒，只是随机地选择其中一种进行复制。于是出现拷贝数偏差。↓两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。因此在复制抑制剂(阻遏蛋白质)浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉(稀释掉)。三、质粒DNA的分离与纯化1．氯化铯-EtBr密度梯度离心原理(1)寄主染色体DNA与质粒DNA高级结构的差异*所谓质粒DNA的分离纯化的分子本质是，在细胞破裂后释放出来的染色体DNA和质粒DNA的混合物中，如何将质粒DNA与染色体DNA区分开来，得到只有质粒DNA的过程。*但是由于质粒DNA与染色体DNA在化学结构上并没有什么差别，因此，要使质粒DNA与其寄主染色体DNA区分开来，达到分离与纯化的目的，就必须从两者DNA的高级结构上寻找突破口。实验表明，在细胞裂解和DNA的分离过