普通植物病理学实验指导(下册)

普通植物病理学实验指导（下册）实验一植物病理徒手制片技术一、实验目的观察植物病害病原物的形态，进行病原物的分类鉴定，研究受病组织的组织结构病变，受病植物组织与病原物的解剖学关系以及对于难得一见病原物的保存备用等，都需将材料制成适当的显微玻片标本。因此，徒手制片技术也是植物病理学研究的重要手段之一。通过本次实验系统学习实践常用的徒手制片技术，为普通植物病理学和农业植物病理学的深入学习以及以后开展病理学的有关研究工作奠定坚实的制片技术基础。二、内容、材料和方法徒手制片的方法有整体封藏法、徒手切片法、组织透明制片法和涂抹制片法等多种。限于时间本实验实践最为常用的整体封藏法和徒手切片法两种。(一)整体封藏法对于生长在植物病部表面或培基上的菌丝体、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及线虫等，可直接择取少许封藏在适当的浮载剂中，在显微镜下观察，根据材料的特点和观察的目的可采用不同的方法封藏制片。常用的方法的概括为挑、刮、拨、撕四种。1挑：对于在植物受病部位或基质表面生长繁茂的霉状病原体(如霜霉菌)粉状病原体(如锈菌、白粉菌)以及培养基上的许多培养菌，可用尖细的解剖针等直接挑取封埋制片，挑取病原体的量，在保证选材典型的前提下，越少越好，以免互相重叠，分辩不清。取黄瓜霜霉病叶，小麦白粉病叶分别挑取霉状物和粉状物镜检病原菌的形态特点。2刮：对病部病原体稀少，或用放大镜也难辩认霉层的病害标本，可采用两侧具刀的三角刮针(或可用刀片代替)刮取病原物制片。刮的方法是，用刮针的一刃，蘸浮载剂少许，在病部顺同一个方向刮取2—3次，将刮得的病原蘸在载玻片的浮载剂中封片镜检。浮载剂在保证浮载质量的前提下要尽量少，否则少量的病原体在大滴的浮载剂中极易分散漂流，在显微镜下难以寻找。取玉米小斑病叶，在病斑背面刮制片，镜检分生孢子梗和分生孢子的形态。3拨：对于产生在植物表皮下或半埋生于基物内的病原体孢子器官。如子囊壳、分生孢子器、闭囊壳等，可将病原体连同寄主组织一同拨下，放入浮载剂中，用两支解剖针，一支稳定材料，另一支拨出植物组织，使病原体外露制片。取小麦全蚀病或白粉病标本，拨小黑点制片，镜检子囊果的形态。4撕：对于寄生在植物表皮细胞上的病原真菌，也可以将此有病原物的表皮撕下来制片镜检，这种方法不仅能看到病原物形态，而且可以观察病原物与寄主的解剖学关系。在毛毛雨天自田间取回感染白粉病的麦苗(或在保温箱中取接种染病的麦苗)。用刀片割破叶背表皮再用小镊子轻轻撕下，放在浮载剂中制片镜检白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形态。(二)徒手切片法欲观察受病组织病变，病菌侵入和寄主体内扩展过程，以及埋生在基物内真菌子实体的形态结构等，都需将有关材料切成薄片，进行镜检，徒手切片是最常用的简便易行的方法，不需要特殊的设备，而且节省时间，切成的片子不仅可作临时观察，也可进一步制成永久性玻片标本。徒手切片的基本用具是剃刀或刀片。切片时先选取材料并作适当的修整，以左手的食指和姆指捏住材料，中指顶住材料下端，使材料上端突出于手指以上2—3毫米。右手握稳刀，从左向右后方斜向切割。注意刀口必须以材料面垂直。否则所得切面不正。同时双手不应紧靠身体，而是要活动自如。用臂力均匀地沿刀口后部起拉向前方，连续切割4—5片后，用毛笔蘸水轻轻沿刀口取下，放入盛有水的浅玻皿中，在此过程中左手握着的材料不要放下，否则再切时难按原位置拿材料，此外，在切片过程中，必须常用毛笔蘸水湿润材料，以免材料干涸不便切割。对于过于柔软或较薄的材料，可以夹在“夹持物”中，进行切片更为方便。新鲜胡萝卜和马铃薯块都可作“夹持物”用。实验室中通常将通草、接骨木或向日葵的茎髓，剪成适当大小，浸于70%酒精中备用。切割一定数量的薄片后，用移置环在浅玻皿中选取合用的材料薄片，放在载玻片的水滴中，镜检合格者即酒精灯上将水烘干并摆正材料，然后加一滴乳酚油或其浮载剂；放在展片台上略加热，镜检如无气泡，即可小心加盖片，用吸水纸吸除多余的浮载剂，最后贴好标签，平放于切片板上，待干燥适宜时封固。徒手切片的缺点是对于微小或过大，柔软、多汁、肉质及坚硬的材料不易切取，也难制成连续切片，此外切片的厚薄也难一致。切片机切片即可克服这些缺点。病名：学名：制片人：时间：切片的标签制法：三、作业和思考题1每人交两片符合质量要求的玻片标本。2整体封藏法和徒手切片法两种基本徒手制片技术都在什么情况下使用?徒手切法制片有什么优缺点?怎样解决这种方法本身存在的问题?附：常用浮载剂及封固剂1水作浮载剂：最常用，但易于干燥，仅适于暂时性检查，不易封固保存，且易形成气泡(检查材料以酒精、5%明胶、水或稀肥皂水稍浸，洗净后再以水浮载可除去气泡)。2乳酚油：也较常用，成分及配比如下：苯酚结晶(加热熔化)20ml乳酸20ml甘油40ml蒸馏水20ml乳酚油不易干燥，标本可存放几天以上，为使标本易于辩别，常在其中加染料苯胺蓝(棉蓝)，用量是0.05—0.1%(也有的加0.2—0.5%的锥虫蓝等)，因其是酸性染料，可染真菌原生质而不染细胞壁，故对分隔难辨的真菌孢子等可由此染色而看清。此法一般只用观察菌态，不适于测量孢子的大小(因为乳酚油的折射率近于孢子和菌丝体，1.43左右)。另一方面，此法制片，封固比较困难(因为乳酚油易于和封固剂起化学作用而分解)，可用达马树脂(和乳酚油不起化学作用)和等量蜂蜡混配做封固剂，蜂蜡放于玻璃皿中在水槽上熔化(温度勿过高)，达马树脂在铁罐中熔化(温勿过度)，然后将蜂蜡倒入熔化的达马树脂中搅和而成(加少量的贴金胶水，可增进与玻璃的附着力)，封固时以“L”形铜棒等在煤气灯上烧热后，蘸少许封固剂在盖玻片周围封固，此封固剂干燥快，经久不坏。但由于其致癌作用而逐渐被淘汰而改用甘油乳酸液。3甘油乳酸液：也可加苯胺蓝等染料，其成分如下：乳酸500ml甘油1000ml蒸馏水500ml4水合氯醛碘液：成分配比如下：水合氯醛100g碘化钾5g碘1.5g水100ml碘与碘化钾研和，加水溶解。然后与水合氯醛混合，此浮载剂较好，能使真菌组织透明，并染上颜色，能弥补乳酚油的不足，一一看清细胞壁和其它结构，此法制片只可保存几天，不宜久存，为保存，可除去碘液再用乳酚油浮载后封存。5甘油：此浮载剂适于保存藻类、水霉菌等柔软标本将标本放在一滴10%的甘油中，加盖玻片，水分蒸发后，随时补加甘油至水分蒸发净，制成的标本玻片平放可经久不坏，(擦去多余甘油，用香脂油或其它封固剂封固，可永久保存)。6甘油明胶：成分及配方如下：明胶5g甘油35ml水30ml明胶在水中浸透，加热至35℃溶化，加甘油搅和，用纱布过滤后使用。徒手切片及其它标本，都可用此剂浮载制片，标本染色(或不染)后，先用甘油脱水(干燥标本可不脱水)，挑取小团甘油明胶放在载片上，微加热，待其熔化而气泡消失后，将标本取出吸除去多余甘油后移入熔化的甘油明胶中，加盖玻片轻轻下压，擦去盖玻片周围的多余甘油明胶。平放十几天，干后长期保存，用香脂或其它固剂封固后长久保存。此浮载剂对于干燥标本易出气泡，用醋酸甘油先予处理可防此弊，成分配比如下：醋酸钾(2%水溶液)300ml甘油120ml酒精180ml标本放在载玻片上加小滴醋酸甘油，微加热以除气泡，并蒸去大部分油剂，趁热加入小团甘油明胶，熔化后加盖玻片，其后步骤同上。普通植物病理学实验指导（下册）实验二培养基的配制和灭菌一、实验目的微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养微生物、为其生长发育提供所需营养的基质。培养基配好后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物试验，因此培养基的配制和灭菌是植物病理实验室中最基本的工作，通过本次实验学习植病实验室中常用培养基的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。二、内容、材料和方法(一)培养基的配制培养基按组成成分及对这些成分了解的程度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基三类，从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类，培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于时间，本次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。1马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）这是植病实验室最常用的培养基(简称PSA)，主要用于植物病原真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌。成分：马铃薯200克蔗糖10克琼脂20克加水至1000毫升方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH，培养细菌则调节pH至中性，此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pH。5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。2牛肉膏蛋白胨培养基（NA）这种培养基主要用于细菌的分离和培养成分：牛肉浸膏3克蛋白胨10克蔗糖10克酵母浸膏1克琼脂20克加水至1000毫升方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调节pH至7，趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要先称好杯和棒的重量后，再开始沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。调节培养基pH至中性的方法如下：配成1N的HCl和NaOH，并另分别稀释配成1/20N的HCl和NaOH。取培养基2毫升，加蒸馏水7.5毫升，加指示剂溴百里酚蓝指示剂5滴，这时如培养基的测样呈黄色则用有刻度吸管加入1/20N的NaOH若呈蓝色则加入1/2ON的HCl，使培养基最后呈草绿色即调节到中性，此刻所加酸或碱的毫升数的25倍即等于在1000毫升培养基中所需要加入lN的NaOH或HCl的毫升数(注意这次是作500毫升培养基)，加蒸馏水稀释的目的防止调节过程中培养基凝固。调节pH至中性的简便方法是用石蕊示纸。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培养基和溴百里酚蓝或其它指示剂1—2滴，根据颜色反应，在所配的培养液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取样测定，如此反复多次，达到所需求的反应为止。5人分为一组，3、4两组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约100毫升，灭菌后摆成斜面，其余300毫升分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善存放，留待下次实验使用。此外，1、2、3、4各组均制备15管试管装和2瓶三角瓶装的无菌水。(二)培养基的灭菌为了得到某种病原物的纯培养，配好的培养基必须经过灭菌才能使用，灭菌是指用物理或化学方法完全杀死器物表面及其内部的所有微生物，灭菌与消毒的概念不同，消毒则是指消灭器物或植物组织表面的某些微生物(能常称杂菌)，而不是消灭所有的微生物。灭菌的方法很多，植病实验室常用的有干热灭菌和高压蒸汽灭菌两种方法，一般培养皿、吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌。而培养基和实验用的土壤，则用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，具体灭菌方法和步骤如下：1干热灭菌法(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁筒)，包纸时应将吸取的一端放在取时先折开的一端，以便取用时手勿触及要求灭菌的一端。(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。(4)待箱内空气排出到一定程度时，闭上排气孔，继续加热至一定温度后，用定温固定温度，灭菌温度一般165℃—175℃保持1小时即可。(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。2高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它的原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下：(1)关好排水阀门放入清水至标度为止，注意水量一定要加足，否则容易造成事故。(2)将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度(不要太紧)，然后再