实验八 酵母RNA的提取及成分鉴定(浓盐法)

生物化学与分子生物学实验实验八酵母RNA的提取及成分鉴定（浓盐法）生物化学与分子生物学实验实验目的掌握浓盐法提纯RNA的基本原理和方法了解RNA成分鉴定的原理及其方法生物化学与分子生物学实验实验原理核酸的分类与分布DNA：主要存在于细胞核的染色体中,线粒体、叶绿体、质粒有少量RNA：存在于细胞质中生物化学与分子生物学实验样本的选择：酵母RNA（RNA占干重的3%-10%）制备方法：稀碱法、浓盐法生物化学与分子生物学实验破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中制备过程：生物化学与分子生物学实验RNA以可溶性钠盐的形式游离析出离心去除菌体,收集上清液,调至RNA的等电点（pH2～2.5）使RNA沉淀析出，离心收集沉淀乙醚洗涤沉淀、去除杂质、提纯RNA浓盐加热使酵母细胞壁破裂，蛋白质变性沉淀RNA提取方法(浓盐法)生物化学与分子生物学实验RNA成分鉴定RNA在强酸性条件下沸水浴加热可以水解：生物化学与分子生物学实验1.磷酸鉴定通过鉴定RNA的三种水解产物来鉴定RNA:钼酸铵磷钼酸+FeSO4钼蓝（蓝色）生物化学与分子生物学实验2.碱基(嘌呤)鉴定生物化学与分子生物学实验3.核糖鉴定5-甲基间苯二酚（蓝绿色）糠醛生物化学与分子生物学实验仪器试剂仪器精密pH试纸（pH0.5～5.0）、广泛pH试纸（pH1～14）、冰块、锥形瓶、离心机、天平、电炉干酵母、10％NaCl、6MHCl、冰块、5％氨水、(NH4)2MoO4试剂生物化学与分子生物学实验实验操作酵母RNA提取（4人一组）1.酵母破壁：10％NaCl(40mL)100mL锥形瓶煮沸加入干酵母（一勺）沸水浴40min取出冷却玻棒搅匀生物化学与分子生物学实验取出锥形瓶自来水冷却后转入50mL离心管3500rpm离心5min取上清2.离心分离RNA两两平衡后对称放入离心机中生物化学与分子生物学实验3.沉淀提纯RNA将上清液转入小烧杯中（不可带入沉淀）冰浴中冷却用6MHCL调pH值至2.0～2.5(RNA等电点)冰浴中静置5-10min（可见烧杯底部有大量沉淀）轻轻摇匀后转入离心管，两两平衡后对称放入离心机3500rpm离心5min，并收集沉淀精密试纸如何调pH值？2.0生物化学与分子生物学实验RNA成分鉴定1.溶解RNA2.水解RNA（此处开始2人一组）加22d1.5MH2SO4沸水浴10min取5mlRNA至大试管溶液澄清加1d蒸馏水搅成糊状加10ml蒸馏水搅匀加5%氨水至pH6-7，继续滴加至沉淀完全溶解广泛试纸生物化学与分子生物学实验核糖鉴定：20d水解液+20dFe3+·HCL+2d5%的5-甲基间苯二酚3.RNA成分鉴定嘌呤鉴定：20d水解液+20d0.1molAgNO3磷酸鉴定：20d水解液+20d钼酸铵+FeSO4结晶粉加浓氨水至沉淀消失+10d浓氨水沸水浴15min摇匀沸水浴2min沸水浴2-3min？？？（绿豆大小）生物化学与分子生物学实验离心机的使用方法1.选择合适的离心管2.使用天平对所离心样本（包括离心套筒）称量配平3.打开离心机电源，设定离心速度和离心时间4.按“停止”键打开离心机盖子，将样本按中心对称放置5.盖紧盖子，按“离心”键启动离心6.离心结束后，待仪器完全停止转动后方可打开盖子取出离心管生物化学与分子生物学实验实验结果1231号：磷酸鉴定（蓝色）2号：碱基鉴定（红棕色）3号：核糖鉴定（蓝绿色）生物化学与分子生物学实验思考题在酵母破壁时为什么只能水煮沸了以后再放入装有酵母和10%NaCl的三角瓶？本实验中两次调pH值的目的分别是什么？生物化学与分子生物学实验实验九酶法测血糖预习