第十二章 单克隆抗体

1第一节动物细胞制药基础知识一、动物细胞的结构细胞膜细胞质细胞核亚细胞器无细胞壁第十二章单克隆抗体2二、动物细胞代谢•葡萄糖和谷氨酰胺提供能量和合成代谢的前体•葡萄糖受限谷氨酰胺•谷氨酰胺：氮源，受限，消耗其他氨基酸•葡萄糖代谢：进入糖酵解途径，大部分分解为丙酮酸乳酸，分泌到胞外（积累）丙酮酸还可以转化为乙酰辅酶A，进入TCA循环，彻底氧化为CO2和水4%-8%的少部分葡萄糖进入五糖磷酸途径PPP，转化为4、5、7碳糖和NADPH.5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，产生细胞毒性。•谷氨酰胺代谢：进入氨基酸代谢途径，合成其他氨基酸大多数谷氨酰胺在脱氨酶作用下，生成谷氨酸，并释放氨，产生细胞毒性小部分谷氨酰胺通过转氨作用生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖。谷氨酰胺谷氨酸还原酶α-酮戊二酸TCA能量在快速生长的培养系中，转氨作用是主要代谢途径：谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用丙氨酸和天冬氨酸•葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸•常流加葡萄糖代谢和谷氨酰胺，控制整个代谢，避免有毒废物积累3三、动物细胞的分类原代细胞（primarycell):从动物体内直接分离得到的细胞特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似传代细胞（passagecell):原代细胞转接后培养的细胞特点：分裂增殖旺盛二倍体细胞系（diploidcell):原代细胞经过传代、筛选、克隆、纯化后，获得的具有一定特征的细胞系。如：W1-38,MRC-5,ZBS等有限细胞系(finitecell):生长和寿命有限的细胞系，二倍细胞系特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡（寿命取决于细胞来源的物种、年龄和器官）人细胞：50-60代，胚成纤细胞：人50代；鸡胚30代；小鼠8代4三、动物细胞的分类（二）无限细胞系(infinitecell):生长和寿命不受限制的细胞系，能连续传代培养。特点：细胞无限分裂，不具有接触抑制现象，不出现异常染色体连续细胞系(continuouscellline)永久性细胞系（immortalcellline)异倍体工程细胞系（engineeredcellline):采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰，获得具有稳定遗传的独特性状。获得方法：异倍体化，融合或重组转化细胞系：染色体断裂成为异倍体，失去了正常细胞的特点，具有无限增殖能力。特点：可长期培养，倍增时间短，对培养条件和营养要求较低，适用于大规模培养如：Namalwa,CHO,BHK-21,Vero细胞等。√√√5四、动物细胞培养的特性4.1.细胞生长缓慢，分裂周期12～48h，易受微生物污染；4.2.动物细胞较微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；4.3.培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌；4.4.在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程（电荷作用，钙镁离子作用）具有群体效应，锚地依赖性，接触依赖性及功能全能性；→接触抑制（contactinhibition）现象。4.5.培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵；（注：多数分泌胞外，收集纯化方便，得到较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，与天然产品一致）4.6.大规模培养时，不可套用微生物反应的经验；有限细胞系（finitecellline）6五、动物细胞的培养基组成与制备5.1.培养的环境因素温度（37±0.5）oC；渗透压（生理条件下）260～320mOsm/Kg氢离子浓度7.2～7.4，接近中性（不能超过6.8～7.6）其它有机离子主要代谢物补充的代谢物激素影响细胞代谢的其他因素细胞生长的基质各因素间的相互作用5.2.主要因素：培养基组成和浓度温度培养液的酸碱度溶解氧（O2、CO2）—95%空气，5%CO2混合气体，氧的传递非常困难（40%—50%）合适各种代谢物浓度75.3培养基组成5.3.1.AA；5.3.2.维生素类；VB或VB+VC5.3.3.盐类Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-、HCO3-调节渗透压酸碱平衡、酶的活性等；5.3.4.葡萄糖—能量；5.3.5.缓冲系统—磷酸盐CO2→HCO3-；5.3.6.矿物质—来源于血清，无血清时，补充Fe2+、Cu2+、Zn2+、Se2+和其他稀有元素；5.3.7.有机补充物，如核苷类，TCA循环中间产物、丙酮酸盐、类脂等；5.3.8.激素如胰岛素、生长激素；5.3.9.生长因子类各来自于血清中，存在的是一些多肽；粘附因子，如纤维结合蛋白、胶原等。关键因素：葡萄糖；谷氨酰胺；能源浓度高氧气8DMEM培养基（mg/L）L-盐酸Asg42，L-cys24，L-Asn584，L-盐酸His19，L-zle52，L-Leu52，L-盐酸Lys72，L-Met15，L-Phe36，L-Thr48，L-色氨酸8，L-酪氨酸36，L-缬氨酸48，氯化胆碱，叶酸3，肌醇6，烟酸3，泛酸钙3，盐酸吡哆醛3，核黄素0.3，硫胺素3，生物素3，NaCl6800，KCl400，CaCl2200，MgSO4·7H2O200，NaH2PO4·2H2O150，NaHCO32000，Glucose1000。青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，50mg/mL庆大霉素10%小牛血清，1%非必需氨基酸,0.1mol/L丙酮酸钠，1%谷氨酸胺9六、动物细胞培养方法与操作方式6.1细胞培养方式6.1.1.体外培养的动物细胞分为两种类型：非贴壁依赖性细胞→悬浮培养（anchorage-independent）→血液、淋巴组织、肿瘤细胞。6.1.2.贴壁依赖性细胞→贴壁培养（anchorage-dependent）→大多数动物细胞（吸着于带正电荷的固体或半固体表面上生长）其生长必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌或培养基中提供的贴附因子（attachmentfactor）才能在该表面上生长、繁殖。6.1.3.兼性贴壁细胞：如中国地鼠卵巢细胞。小鼠L929细胞。10•贴壁培养成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成骨细胞等中胚层细胞。上皮细胞、皮肤细胞等外胚层细胞和内胚层细胞。滚瓶系统培养→微载体系统培养法（搅拌罐）（搅拌槽，中空纤维管）粘附比率（玻璃、纤维素、明胶等增加了比表面积）。接种细胞密度104/cm2→(1～2)×105/cm2(劳动密集型)•悬浮培养小规模：转瓶或滚瓶大规模：细胞反应器（空气提升式、中空纤维管、搅拌槽）与微生物细胞相比较缺点：细胞密度较低（1～2)×105个/mL→(1～3)×106个/mL。(操作简单、易于放大、均匀、易于控制)•固定化培养（流化床、固定床）116.2细胞培养操作方式分批式流加式半连续式连续式灌流式注意：生物污染（其它动物细胞、微生物、病毒）控制关键：实时检测。12七、动物细胞大规模培养系统•气生式细胞培养系统•微载体培养系统•微束培养系统•大载体系统•中空纤维培养系统•通气搅拌细胞培养系统13•抗体（Antibody.Ab）是有抗原刺激机体后，由淋巴B细胞经分化增殖的浆细胞合成的分泌的，能与响应抗原特异结合并具有多方面免疫功能的球蛋白。•免疫球蛋白（Immunoglobin,Ig）是只具有抗体活性或其化学结构与抗体相似的球蛋白。•Ab与Ig是同义体，已知相应配体的Ig称为抗体。一、基本概念第二节抗体14理化性质及免疫学特性是机体体液免疫的主要成分血液中（主要）环境其他体液外分泌液人的抗体分为五类IgGIgAIgMIgDIgEIg的生化本质：大分子蛋白；具有抗体活性；本身带有多种抗原决定簇，具有一定的抗原特异性。抗原（Antigen）：诱发机体产生抗体的外来物质。二、抗体的分类15三、抗体条件：1.只有脊椎动物（鱼类以上）的浆细胞才能产生；2.必须要有抗原物质的刺激；3.能与相应的抗原发生特异性结合；4.其化学本质是一类具有免疫功能的球蛋白。杂交瘤技术蛋白质工程技术（疾病治疗、诊断）应用广泛发展前景转基因16三、抗体分子的结构和功能3.1抗体分子的结构两条轻链（lightchain,L）两条重链（heavychain,H）二硫键连接L:210个AA残基，分子量2.3×104H:450个AA残基，分子量5.0×104L和H内部具有一系列重复的同源结构单元，每个单元长约110个AA残基。“Y”字形结构，在“Y”字的的两个支角上，占轻链1/2和占重链的1/4.N端是抗原识别位点。抗体的结构示意图17•抗体的功能区（domain）折叠成球状结构（AA排列顺序因抗体的特异性而异）称可变区（Variableregion,简称V区），包括3个互补决定区（VH，VL）（compiementarity-determiningregion;CDR）•羟基-侧，AA排列顺序较恒定→恒定区（constantregion,c区）•H链上有3个C区，CH1，CH2，CH3•L链上有1个C区，CL•铰链区：H链的中间部分肽段。“Y”→“T”互变，不结合抗原，CH2区的补体结合位点被掩盖。18木瓜蛋白酶作用后：Fab片段：抗原结合活性和特异性，一条完整的L链和H链的VH区以及CH1Fab片段：两条H链的CH2和CH3区域Fc片段：无抗原结合活性，但是抗体结合了抗原以后，激活机体免疫反应的主要部位。抗体分解的三个部分19主要激活以下免疫反应：(1)激活补偿功能系统。(2)产生抗体依赖性细胞介导毒素。(3)可结合巨噬细胞的Fc受体，使巨噬细胞吞食并毁灭抗原—抗体复合体。•根据抗体重链的C区（CH）的不同，将人的重链分为γ、μ、ε、δ和α五大类。→形成的Ig分别称为IgG，IgM，IgE，IgA和IgD。203.2抗体的功能中和毒素固定微生物生物学功能中和病毒凝集抗原颗粒结合并沉淀可溶性抗原激活血清补体等。21各类Ig各司其职，共同完成的机体免疫防护任务（1）IgG最主要的免疫球蛋白，15%，参与几乎所有的体液免疫反应。作用：免疫凝集、免疫沉淀、免疫调理、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、激活补体系统、固定细菌和中和病毒。（2）IgA机体粘膜局部防御的重要作用因素功能：杀菌、抗病毒活性和免疫凝集作用（分泌型IgA）。（3）IgM血液中功能：补体激活、防止菌血症和败血症。（4）IgE（5）IgDPcAb：亲和力高，制备过程简单，用于诊断试剂，毒蛇咬伤（特殊情况）抗蛇毒抗血清（PcAb）治疗优于McAb。22第三节单克隆抗体•多克隆抗体（Polycolonalantibody）：同一抗原产生的不同抗体（含有多个抗原决定簇）•单克隆抗体McAb（monocolonalantibody）：由单个淋巴细胞针对某一抗原决定簇产生的单个抗体。（B细胞的纯培养）•上市药物:Reopro,Herceptin,Campath-1H,Zevalin等•单抗的特点：①特异性强②重复性好③操作简便易行（临床诊断快速检测等）医学、临床、药理、食品检测、生化等多个领域。•应用：癌症诊断、药物测定、传染病诊断、临床治疗(如蛇毒等）23骨髓瘤细胞×B细胞（myelomacell）体外生长无限增殖杂交瘤细胞单克隆抗体B淋巴细胞杂交瘤技术（又称单克隆抗体技术）德国Kohler科勒尔首次利用细胞融合技术→制备出单克隆抗体英国Milstein米尔斯坦→并完善了极微量蛋白质检测技术丹麦Jerne杰恩→1984年诺贝尔生理学及医学奖24一、杂交瘤细胞的产生251.杂交瘤细胞系的建立1.1.免疫B淋巴细胞的制备B淋巴细胞即期望能分泌特定抗体的细胞。1.1.1抗原种类不受限制。纯度要求不高，在筛选时采用均一的所期望的抗原来检测。261.1.2.免疫（1）动物BALB/C小鼠，→BALB/C系列，C57BL/6系列。Lou大鼠免疫时尽量采用相同的品系动物免疫，与骨髓瘤细胞在种子上尽量一致。（2）免疫方法应考虑抗原的性质、纯度、制剂的选择，因抗原而异。通常方法：体内免疫（皮下、肌内、腹腔免疫，适用于颗粒性抗原）脾内免疫（来源有限，昂贵的抗原免疫，效果不好）体外免疫（分离B淋巴细胞，用于人McAb，