补体检测及补体参与的试验

补体检测及补体参与的试验补体（complement,C）是一组存在于人和脊椎动物血清、组织液和细胞膜表面，具有酶样活性、不耐热、功能上连续反应的糖蛋白可辅助和补充特异性抗体介导的溶菌、溶血作用补体系统：补体固有成分、补体调节蛋白、补体受体含量相对稳定，疾病状态时含量及活性可发生变化补体的表达方式参与补体激活经典途径的固有成分按其被发现的先后顺序分别称C1、C2、……C9。C1由C1q、C1r、C1s三种亚单位组成补体系统旁路激活途径及调节因子中另一些组分以英文大写字母表示，如B因子、D因子、P因子、H因子等；补体调节成分多以其功能进行命名，如C1抑制物（C1INH）、C4结合蛋白（C4BP）补体活化后的裂解片段以该成分的符号后加小写英文字母表示，通常a为小片段，b为大片段：C2a、C2b具有活性成分的复合物在其字符上划一横线表示，如：C1～C9灭活的补体片段在其字符前加英文字母i表示，如iC3b对补体受体以其结合对象命名，如CLrR、C5Ar、对C3片段受体则用CR1、CR2……CR4表示补体固有成份补体调节蛋白补体受体C1~C9,B、D、P因子C1INH、C4BP、H、I、S蛋白和血清羧肽酶等,MCP,DAF,HRPC1qR、C3b/C4bR(CRI)、C3dR(CRII)、H因子受体、C3a和C5a受体等补体系统组成第一节补体的理化特性与生物学功能90%的血清补体由肝脏合成感染部位活化的巨噬细胞能分泌几乎所有种类的补体成分补体的理化特性血清补体总量约为4g/l，C3含量最高不稳定，易受各种理化因素影响（热不稳定，56℃、30min即被灭活；射线、机械振荡、酒精、胆汁等可破坏补体）在0～10℃活性保持3～4天补体系统的激活1.经典激活途径（classicalpathway，CP)2.旁路激活途径(alternativepathway，AP)3.甘露聚糖（MBL）激活途径1.经典激活途径抗原抗体复合物启动的，由C1—C9参与的一系列的酶促反应，其结果是靶细胞因细胞膜受攻击复合物作用而被裂解激活物：抗原—抗体（IgG、IgM）复合物Immunocomplex，IC循环免疫复合物CircularImmunocomplex，CIC激活顺序：识别阶段-活化阶段-膜攻击阶段2.旁路途径的激活经典激活途径替代激活途径MBL途径激活物质抗原抗体复合物肽聚糖、酵母多糖、脂多糖MBL相关的丝氨酸蛋白酶起始分子C1qC3C2、C4参与成分C1-C9C3、C5-C9、B因子、D因子C2-C9、MASP所需离子Ca2+、Mg2+Mg2+Ca2+C3转化酶C4b2bC3bBbC4b2bC5转化酶C4b2b3bC3bnBbC4b2b3b生物作用参与特异性免疫的效应阶段,感染后期发挥作用参与非特异性免疫的效应阶段,感染早期发挥作用参与非特异性免疫的效应阶段,感染早期发挥作用三种补体激活途径比较补体系统的生物学功能1.溶解细胞、细菌和病毒2.调理作用3.清除免疫复合物4.引起炎症反应5.免疫调节作用•血清总补体活性测定（CH50试验）:以红细胞的溶解为指示，以50%溶血为判断终点。•CP-CH50•AP-CH50•MBL-CH50第二节血清总补体活性测定（一）实验原理：特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血，溶血程度与补体的活性有关，与补体的剂量依赖呈S型曲线。30%-70%呈直线，50%溶血为终点（二）试验方法•红细胞浓度的调整：2%~5%绵羊红细胞（SRBC）悬液•溶血素的配制：是以SRBC免疫家兔所得的兔抗血清，即兔抗绵羊红细胞抗体。试验前要灭活补体及进行溶血素的稀释和滴定。•稀释缓冲液：PH7.2~7.4磷酸盐缓冲液，必须含有Ca2+、Mg2+不同稀释度溶血素的配制最终稀释度稀释液(ml)稀释度溶血素（ml）1:10001.81:1000.21:20000.21:10000.21:30000.41:10000.21:40000.21:20000.21:50000.81:10000.21:60000.21:30000.21:80000.21:40000.21:100000.21:50000.2所加溶血素溶血素的滴定•11：10000.10.20.20.1全溶血•21：20000.10.20.20.1全溶血•31：30000.10.20.20.137℃全溶血•41：40000.10.20.20.130分钟全溶血•51：50000.10.20.20.1大部分溶血•61：60000.10.20.20.1微溶血•71：80000.10.20.20.1不溶血•81：100000.10.20.20.1不溶血•9对照－－0.20.1不溶血管号溶血素试管内加入的试剂量（ml）稀释度溶血素补体(1:60)缓冲液2%SRBC结果以最高稀释度的溶血素仍能产生完全溶血为最大有效反应管(1:4000)即为1个单位，一般试验使用2个单位(1:2000)50%溶血标准管配制混匀后取2.5ml，随试验一起孵育。试剂用量溶血程度2%SRBC0.5ml100%DH2O2.0ml1.8%Nacl2.0ml50%2%SRBC0.5ml血清总补体50%溶血活性测定（U/ml）•10.101.400.50.5•20.151.350.50.5•30.201.300.50.5•40.251.250.50.5•50.301.200.50.5•60.351.150.50.5•70.401.100.50.5•80.451.050.50.5•90.501.000.50.5•100.001.500.50.537℃，30分钟，2500r/min离心，与50%溶血标准比较试管号1:20稀释血清巴比妥缓冲液2u溶血素2%SRBC按以下公式计算50%溶血的总补体值CH50（U/ml）=×稀释倍数总补体活性参考范围:50-100U/ml反应总体积2.5ml为常用1血清用量（三）方法评价•CP-CH50测定经典途径总补体溶血活性•反应的是补体9种成分综合水平•方法简便、快速，但敏感性较低•影响因素多：缓冲液pH、离子强度、Ca2+、Mg2+浓度等，各个环节严加控制。主要检测的单个补体成分：C3、C4、C1q、B因子和C1抑制物方法：1.免疫溶血法测定补体的溶血活性2.免疫化学法测定补体的含量第三节单个补体成分的测定一、免疫溶血法原理：抗原与特异性抗体结合后可激活补体的经典途径导致红细胞溶解。当缺乏某一单个补体成分时，不能使补体连续激活，指示系统不发生溶血；加入待测血清，若含原来缺乏的补体成分，则级联反应恢复，产生溶血，溶血程度与待测单个补体成分活性有关以50%溶血为终点测定成分C4B因子补体来源豚鼠血清正常人血清处理方法氨水加热去除成分C4B因子指示系统致敏红细胞兔红细胞结果不溶血不溶血加入待测血清补充成分C4B因子结果溶血溶血溶血途径经典途径旁路途径、溶血素、溶血素注:兔红细胞可直接活化补体的旁路途经二、免疫化学法•单向免疫扩散法•火箭免疫电泳•透射比浊法•速率散射比浊法免疫浊度测定（第六章P67）可溶性抗原和相应抗体特异性结合（两者在比例合适和增浊剂作用下），可快速形成较大的免疫复合物，使反应液出现浊度。抗体过量的情况下，反应液的浊度与待测抗原量呈正相关透射免疫比浊试验检测的是透射光，即免疫复合物形成后，反应液浊度变化，引起透射光的改变抗体用量大，耗时长，不宜用于药物半抗原的检测散射免疫比浊试验检测的是散射光终点散射比浊试验——在抗原-抗体反应达到平衡时测定散射光强度速率散射比浊试验——抗原抗体结合反应的动力学测定方法，临床上使用的主要方法学胶乳增强免疫浊度测定•利用补体的溶细胞作用，将其作为试剂成分参与试验•可对各种抗原或抗体以及免疫复合物进行检测第四节补体参与的试验补体结合试验complementfixationtest,CFT反映经典途径的抗原抗体反应应用绵羊红细胞和溶血素作指示剂检测抗原或抗体一、试验原理补体结合试验三个系统反应系统：已知抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）补体系统：豚鼠血清指示系统：与溶血素结合的致敏绵羊红细胞SRBCS图19-3二、方法评价•灵敏度高0.05ug/ml•特异性强•结果明显•试验条件要求低•参与成分多，操作繁琐补体参与的其他试验C1q抗体的测定试验•将C1q作为抗原检测患者血清中的抗C1q抗体•抗C1q抗体是一种自身抗体，临床上主要用于狼疮肾炎的诊断和监测，低补体血症性荨麻疹性血管炎、膜增生性肾小球肾炎和Felty综合征（指除有典型的类风湿关节炎临床表现外，还伴有脾脏肿大和白细胞计数减少的一种严重型类风湿关节炎）的诊断•采用ELISA方法检测1.与补体降低相关的疾病2.高补体血症(心梗和某些恶性肿瘤)第五节补体测定的临床意义补体缺陷•在临床上偶尔可以见到一些补体先天性缺陷的病人，C2缺陷和C1INH缺陷相对较常见，其它补体成分的缺陷均非常罕见。•补体先天性缺陷患者的两大临床表现是反复感染和自身免疫病，这也从反面证实了补体在抗感染免疫和免疫调节方面的重要意义。补体缺陷的临床表现临床表现主要相关的缺陷补体成分次要相关的缺陷补体成分遗传性血管神经性水肿C1INH严重顽固性皮肤损害C1q反复发作性细菌感染C3，I因子C1r，C1q免疫复合物性血管炎（包括肾炎）C1q，C1r，C4，C2C3，C5反复发作性革兰氏阳性球菌感染C5，C6，C7，C8系统性红斑狼疮CR1C1IHN缺陷引起血管神经性水肿继发性补体降低：消耗增多：SLE、RA、自身免疫性溶血大量丢失：大面积烧伤、失血及肾脏病患者补体合成不足：肝脏疾病或营养不良补体活性及含量的测定对自身免疫病的诊断、有无疾病的活动以及疾病的进程和疗效的判断等提供重要依据高补体血症•偶见感染恢复期•恶性肿瘤•急性病毒性肝炎、心肌梗死、糖尿病补体与病毒感染•补体受体及补体膜表面调节蛋白与病毒感染的关联受到越来越多的重视，一些病毒可通过补体受体等感染宿主细胞，例如，EB病毒通过CR2感染B细胞，麻疹病毒通过MCP感染机体细胞，柯萨其病毒、埃可病毒和肠道病毒可通过DAF感染细胞等。•临床上可考虑应用补体受体的阻断剂治疗某些病毒感染性疾病。补体与器官移植的超急性排斥•目前研究结果表明，超急性移植排斥的主要原因是补体系统的全身性激活，导致对机体自身的广泛性组织损伤，产生致命的后果。•目前在临床前研究的解决方案是：（1）利用补体抑制剂如可溶性CR1进行药物治疗；（2）考虑应用转基因技术解决这一问题。•目前已开展了CR1、DAF、CD59、MCP等膜表面补体调节蛋白转基因猪的实验研究，将这些人类基因在胚胎期转入猪胚胎细胞后，使其发育成含有人类基因的转基因猪，将其器官移植至灵长类动物后，由于补体调节蛋白对补体的抑制作用，可有效阻止超急性移植排斥的发生，使移植的器官存活时间明显延长。补体与炎症性疾病•补体在活化过程中产生的片段具有一些新的生物学活性，其中C5a，C3a，C4a具有过敏毒素效应，C5a具有趋化活性，这些片段在促进炎症反应中起重要作用，因而在一些炎症相关的疾病中，补体起重要的病理作用，包括自身免疫病、心血管疾病、感染过程中的炎症性组织损伤、超急性移植排斥等。•通过抑制补体有可能收到治疗疾病的效果补体测定的应用诊断病原体感染检测补体的功能CH50检测单个成分的含量及活性C3、C4、PFB免疫性疾病相关疾病时补体的检测与补体相关的遗传性疾病补体含量显著降低的疾病高补体血症补体参与的试验溶血空斑实验、抗C1q抗体检测流行病学调查补体应用于临床治疗后的检测小结主要内容–补体定义–活化途径–CH50测定原理（免疫溶血法测定的是补体的溶血活性）–补体含量的测定（与第六章免疫比浊试验结合起来）–补体结合试验的基本原理–补体系统的异常与疾病英语词汇Complement，MBL，CH50，SRBC，complementfixationtest（CFT）