第2节植物体细胞胚胎发生

第2节植物体细胞胚发生体细胞胚（somaticembryo）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。胚的发育图一、体细胞胚的概念(A)伸长期合子；(B)合子经过第一次分裂,产生1个顶细胞(绿色)和一个基细胞(粉红色)；(C)四分体胚:顶细胞经历2次纵向分裂，产生含有4个细胞的胚体和2个细胞的胚柄；(D)16细胞球形胚:8细胞胚的所有细胞经过1次平周分裂,产生包含8个细胞的表皮原和8个细胞的内部组织；(E)早期心形胚；(F)心形胚:子叶和胚根原基已经出现；(G)成熟胚胎。1:顶细胞;2:基细胞;3:胚根原细胞,形成未来的ROC和根冠中央区;RM:根尖生长点;SM:茎尖生长点双子叶植物的胚胎发育过程花粉培养单细胞悬浮培养原生质体培养组织器官培养体细胞胚花粉胚非合子胚非合子细胞合子胚无融合生殖胚**大量研究表明，大多数植物组织培养，单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生（pollenembryogenesis）**前者为二倍体的体细胞产生的胚状结构**后者是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，通常称花粉胚（pollenembryos），可发育成单倍体植株。体细胞胚的产生**体细胞胚或花粉胚都是指在植物组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的胚状结构，包括以下几点含义：1、体细胞胚是组织培养的产物，区别于无融合生殖的胚，只限于在组织培养范围使用；2、体细胞胚起源于非合子细胞，区别于合子胚；3、体细胞胚的形成经历胚胎发育过程，区别于组织培养的器官发生中芽与根的分化。胚胎发生过程：原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶形胚期植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点：1、具有两极性2、存在生理隔离3、遗传性相对稳定4、重演受精卵形态发生的特性二优点数量多速度快结构完整三、体细胞胚胎发生的方式**植物组织培养过程中植物体细胞胚胎途径可归纳为两类：直接途径和间接途径。**直接途径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成**间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成，如香雪兰（Freesiarefracta）花序外植体经直接体细胞胚胎发生途径形成再生植株。**外植体形态学极性决定体细胞胚胎发生，所有体细胞胚都出现在花序轴切段的原形态学下端。1直接途径直接发生体胚的来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、幼胚、悬浮培养的细胞和原生质体。一般认为直接方式发生体胚是由原先就存在于外植体中的胚性细胞――预胚胎决定细胞（PEDCs）培养后直接进入胚胎发生而形成体胚，如柑桔属的珠心组织（在体内或离体情况）通过预胚胎决定细胞直接进行体胚发生的最好例子.2间接途径间接体细胞胚胎发生中，外植体已分化的细胞先脱分化，并对其发育命运重决定而诱导出胚性细胞――诱导胚胎决定细胞（IEDCs），进而形成体细胞胚。石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程1茎尖培养诱导形成胚性愈伤组织MS培养基附加2.0mg/L2,4-D2胚性愈伤组织悬浮培养增殖MS培养基附加2.0mg/L2,4-D3由细胞集合体形成体细胞胚MS培养基附加2.0mg/L2,4-D4体细胞胚萌发并形成小植株MS培养基附加1.0mg/LABA图甘薯品种栗子香胚性愈伤组织诱导体细胞胚和再生小植株胚性愈伤组织非胚性愈伤组织颜色淡黄白色表面光滑粗糙质地坚硬但易碎松散，水渍状胚性细胞的多少大量极少或无细胞形态小，圆球形管状或不规则形细胞质浓厚，染色深稀薄，染色浅内含物多少细胞核及核仁核明显，大，核仁多核小，核仁少，或无核胚性细胞团特征：成簇、成团，体积小，细胞质致密四.体细胞胚的结构与发育特点体细胞胚多起源于一个胚性细胞,胚性细胞经过首次分裂形成二细胞原胚,以后经过细胞分裂形成多细胞原胚.在多数情况下,胚性细胞的第一次分裂为平周分裂,形成的2个子细胞,处于上部的顶细胞继续进行细胞分裂形成多细胞原胚,而下部的基细胞成为胚柄类似物.四、体细胞胚的起源**体细胞胚胎发生途径有直接途径和间接途径，但无论哪一种发生途径，绝大多数研究报道认为体细胞胚胎起源于单细胞,从多种植物中都观察到单个胚性细胞，有不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究认为起源于多细胞。**在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上可以观察到多个不同发育时期的体细胞胚，从单个原始细胞到多细胞的原胚、球形胚、鱼雷胚直至具子叶的胚状体，这是由体细胞胚发生和分裂的不同步所致。香蕉心形体细胞胚可可心形胚A和球形胚BAB1体细胞胚的单细胞起源野胡萝卜的胚状体A.心形期胚状体B.成熟胚状体C.早心形期胚状体D.两个成熟胚状体共一个胚柄a)胚性细胞第一次分裂；b-d)原胚第一次细胞分裂，鳄梨树形胚柄细胞仍保持单个细胞；e)胚柄细胞开始增殖；f-k)原胚和胚柄发育的不同时期；l)球形体细胞胚。(ep)=原胚；(s)=胚柄图仙人掌科体细胞胚胎早期发育（由单细胞形成球形胚时期）a胚性叶片愈伤组织；b球形细胞；c伸长细胞；d两个细胞时期；e四个细胞时期；f原胚；g球形胚；h心形胚；i早期鱼雷胚；j成熟鱼雷胚；k不同时期的体细胞胚；l体细胞胚的萌发；m再生小植株。图木豆幼苗叶片愈伤组织悬浮培养体细胞胚发育过程**有的学者观察到体细胞胚来源于多细胞组成的胚性细胞复合体，王亚馥等人也观察到这种胚性细胞团，但用同位素脉冲标记实验即可证明这些细胞团也是由一个单细胞连续分裂而形成，经进一步分化和分裂形成不同发育时期的体细胞胚，因而这些体细胞胚实质也可能是起源于单细胞。当然也不排除有些植物的体细胞胚的确是起源于多细胞，仍有待深入研究。**总之，体细胞胚胎的发生是一个非常复杂的生理过程，仍有许多问题尚需进一步研究。2体细胞胚的多细胞起源大多数体细胞胚起源于单细胞,通过体细胞胚胎形成的再生植株,其遗传特性相对稳定.而器官发生途径的再生植株来源复杂,形成的个体常为嵌合植株;从体细胞胚形成的过程可知,体细胞胚的发育过程与合子胚基本相同.但在形态结构和生理特性与合子胚有一定的区别.1.合子胚在发育初期具有明显的胚柄,而体细胞胚一般没有真正的胚柄,只有类似胚柄的结构.特别是那些发育初期类似于动物胚胎发育途径的体细胞胚,这一点更为明显.2.合子胚的子叶相当规范,可以作为分类的依据,如单子叶植物只有一片子叶,双子叶植物有两片子叶.而体细胞胚的子叶不规范,有时具有两片以上的子叶.3.体细胞胚的体积明显小于合子胚.在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异.如体细胞的干物质如蛋白质,多糖等显著低于合子胚.4.体细胞不能有明显的脱水干燥过程,因此体细胞胚的含水量比合子胚要高得多5.体细胞胚还有一个明显的特点就是没有休眠.合子胚在胚胎发育完全进入子叶期后,经过一系列物质积累和脱水进入休眠,而体细胞胚则直接形成植株.五、影响体细胞胚发生的因素1、基因型与体细胞胚发生基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞胚的诱导率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而异。（a）不同基因型体细胞胚诱导率；（b）不同基因型每个胚性外植体上体细胞胚的数目图6.7在相同培养基上FeijoasellowianaBerg不同基因型体细胞胚诱导（引自Miguel等，2001）2、植物激素与体细胞胚发生**离体植物细胞在开始往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力，但是在大多数情况下，这些细胞的分裂和分化以及形态建成过程中又必需生长素和细胞分裂素两种激素的共同作用。**在培养介质中添加不同种类或不同浓度的外源激素诱导形态发生已受到广泛的重视。**但最关键的是组织内部和体细胞胚发生部位的内源激素代谢动态和平衡。（1）内源激素与体细胞胚发生早在胡萝卜细胞悬浮培养体细胞胚发生中发现，2，4-D在诱导胚性细胞早期是必需的，而且2，4-D是通过影响IAA结合蛋白起作用，其实质是促进IAA结合蛋白的形成，提高细胞对IAA的敏感性从而诱导胚性细胞的形成。水稻细胞培养中也发现，由于2,4-D促进细胞内源IAA含量提高进而诱导胚性细胞的形成，并认为内源IAA含量上升或维持在较高水平，是胚性细胞出现的一个共同标志。一些研究表明，ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。外源ABA与内源ABA对体细胞胚发生起到相互调节和促进的作用，而且通过补充提高外源ABA，可以明显提高体细胞胚发生的频率与质量。荔枝体细胞胚胎发生早期的内源激素ABA与IAA和ABA与CTK（细胞分裂素）的质量比增大，将有利于荔枝体细胞球形胚的形成。（2）外源激素与体细胞胚发生①2，4-D与体细胞胚发生2，4-D是诱导多种植物离体培养体细胞转变为胚性细胞的重要激素。单子叶植物和双子叶植物诱导体细胞胚胎发生时，所要求的2,4-D的浓度不同，对单子叶植物而言，一般要求较高浓度的2,4-D，其浓度范围为0.5-5mg/L，通常使用浓度为2mg/L；而对双子叶植物而言，一般要求较低浓度的2,4-D，其浓度范围为0.02-1mg/L，通常使用的浓度为0.1mg/L。在体细胞胚胎发生的诱导阶段，培养基中必需添加2,4-D，而在体细胞胚胎形成阶段，要降低培养基中2,4-D的浓度或去除2,4-D，以保证体细胞胚的正常生长。在胡萝卜细胞培养中，加入2，4-D后诱导一些特异性多肽或蛋白质形成，当去除生长素后，这些多肽和蛋白质也随之消失。但在诱导出胚性细胞后，及时除去培养基中的2，4-D，胚性细胞在进一步分化和发育的同时释放糖蛋白GP65（65kDa）表在MS固体培养基上不同浓度2,4-D对木豆幼苗叶片外植体诱导和原胚细胞形成的影响2,4-D(μM)Callusinduction(%)Proembryoniccell*(%)0.000.00.02.263.2d3.4d4.527.4c10.2c6.7838.6a37.4a9.0418.2b12.8b11.303.6c2.2c表在具有不同浓度2,4-D的MS液体培养基上木豆不同时期体细胞胚诱导率2,4-D(μM)收集细胞的体积(10thday)体细胞胚发育时期球形胚(%)心形胚(%)鱼雷胚(%)0.0000001.122.8e2.4e1.8e1.2e2.263.2d7.6d2.4d1.6d3.384.6c20.2b8.2b5.2b4.525.2b36.2a20.4a16.4a5.645.6b18.6c6.6c3.6c6.786.2a7.4d1.6e1.2eOriginofembryoidsinembryo-derivedcallusculture.(a)Singlecells(arrow)andtwo-celledstage(doublearrows).x137.(b)Four-celledstage(arrowhead).x137.(c)Multicelledproembryocontainingeighttotencells.x137(d)Epidermizedlobularstage.x34.(e)Heartshapeembryoidthatremaininthecallus.X34.(f)Severalcompactembryoidsindifferentstagesofformation.x14.A,C,E为离体培养6周后的体细胞胚；B,D,F为离体培养5个月后形成的体细胞胚A:品种GK7，在添加83.0mMcentrophenoxine培养基上;B:品种AT120，在添加124.4mMcentrophenoxine培养基上;C:品种59-4144，在添加12.4mMdicamba培养基上;D:品种AT120，在添加83.0mMdicamba培养基上;E:品种VC1，在添加83.0mMpicloram培养基上;andF:品种VC1，在添加124.4mMpicloram培养基上.图含不同种类和不同浓度生长素固体培养基上成熟花生胚轴体细胞胚诱导②其它生长激素与体细胞胚发生除2,4-D外，ABA对植物体细胞胚的发生也起到重要的调控作用。研究