65实验设计

2012级本科分子生物学实验设计年级、专业、班级：实验课时间：实验室：组别：组员排名（按姓氏排名）：报告人：患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。案例：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（俗称蚕豆病）初步诊断为：•诱因：一天前食用蚕豆•既往史：姐姐也曾出现过此症状•临床表现：皮肤及巩膜黄染、尿液呈酱油样蚕豆病发病机制食用蚕豆产生大量过氧化氢，不被清除红细胞膜脂质被氧化破坏急性血管内溶血，产生过多胆红素导致溶血性黄疸，恶心，呕吐，尿液呈酱油样红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定【实验目的】•检测患者体内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性以及发病原因•掌握紫外法测定G6PD活性的原理及方法•了解蚕豆病的发病机制及原因【实验原理】G6PG6PD6PGANAPDNADPH340nm,最大吸收峰A340血红蛋白氧化高铁血红蛋白540nm,最大吸收峰值A540}比色法G6PD活性【实验器材与试剂】器材：取血针、恒温水循环紫外分光光度计、可见分光光度计、离心机试剂：生理盐水、缓冲液、NADP+、G6P-Na2、溶血剂、血红蛋白氧化剂、0.9％NaCl、ACD抗凝剂【实验步骤】1.洗涤红细胞：取血2.0mL放入0.4mLACD抗凝剂的试管0.2mL抗凝血，4mL预冷的生理盐水，离心﹙2500r/min,5min﹚沉淀2.溶血液的制备：2.0mL溶血剂，震荡1min，4℃放置10min待测定试剂体积蒸馏水﹙μL﹚20240.5mol／LTris-HCLMgCL2缓冲液溶液﹙μL﹚3006mmol/G6P-Na2﹙μL﹚3002mmol/LNADP+﹙μL﹚300混匀后放入带恒温水循环（25℃）的紫外分光光度计中，预热10min，然后在“测定”中加入溶血液60μL，“空白”中加入“溶血剂”60μL，混匀以“空白”调零，1min后测A340，每2min记录吸光度一次至10min,比较每2minA值的变化情况，若相近则表明酶促反应平稳。并计算平均变化的A值。3.取石英比色杯两只，标为“测定”及“空白”，按下表操作：试剂体积Drabkin(ml)3.0溶血液(ml)0.3混匀，室温放置15min,以Drabkin试剂调零，读取540的吸光度（A540）。4.溶血液中血红蛋白含量的测定取试管一支，按下表操作：【实验结果】1.NADPH产量的计算：NADPH在340nm处，其每微摩尔的吸光系数（ε）为6.220，故10min内MADPH的产量计算公式为：NADPH产量﹙μmoL﹚=A3406.222.血红蛋白含量的计算：血红蛋白氧化为高铁血红蛋白以后，在540nm处，其毫摩尔的吸光系数（ε）为44，故溶血液中血红蛋白的含量计算公式为：血红蛋白含量(mmoL)=A540443.G6PD比活性的计算：G6PD比活性单位(U/gHb)=A340A540×49.85【参考范围】G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断【结果分析方法】大于2.8U/gHb【注意事项】1、洗涤红细胞时禁止剧烈震荡，避免溶血。2、测定NADPH时读取吸光度的时间要准确。1.血尿、排酱油色尿、面色苍白2.皮肤及巩膜黄染3.体温升高4.呼吸急促主要临床表现：1.血尿、排酱油色尿、面色苍白G6PD↓GSH的主要作用：①保护红细胞内的含硫氢基（-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化②与谷胱甘肽过氧化酶共同使H2O2还原成H2O→NADPH+H+↓→红细胞的抗氧化能力↓→GSH↓→红细胞膜破裂→溶血性贫血（面色苍白）→游离Hb→血红蛋白尿2.皮肤及巩膜黄染3.体温升高机理：红细胞破裂↓血红蛋白暴露↓免疫系统攻击（单核-吞噬细胞系统）↓体温升高4.呼吸急促溶血性贫血↓具有载O2能力的Hb含量下降↓机体缺O2↓呼吸急促要想探讨该病发生的分子基础，需要检测G6PD基因，可以用一下技术来检测：经本组成员讨论，认为患者体型瘦小与该病症有关，其原因：溶血性贫血红细胞比容下降营养物质运输不足缺乏营养体型瘦小Thankyou