山东花生腐霉根腐病病原鉴定

山东花生腐霉根腐病病原鉴定摘要：利用组织分离技术和选择性培养基纯化技术对山东地区花生腐霉根腐病的病原菌进行了分离和纯化。按照柯赫法则，根据余永年真菌形态学鉴定方法及利用ITS序列比对等分子生物学方法对病原菌进行了鉴定。结果表明，引起山东地区花生腐霉根腐病的病原菌为群结腐霉（PythiummyriotylumDrechsler）、旋柄腐霉（PythiumhelicoidesDrechsler）、畸雌腐霉（PythiumirregulareBuisman）以及终极腐霉（PythiumultimumTrow）。关键词：花生；腐霉；根腐病；鉴定IdentificationofPeanutPythiumRootRotPathogeninShandongAbstract：PathogenofpeanutPythiumrootrotpathogeninShandongwasisolatedandpurifiedbytechniquesoftissueisolationandselectivemedia.BasedonKoch’srule,thepathogenwasidentified.bythemethodsofFungalmorphologicalandITSsequencealignment.AnditindicatedthatthepathogenofpeanutPythiumrootrotpathogeninShandongwasPythiummyriotylumDrechsler、PythiumhelicoidesDrechsler、PythiumirregulareBuismanandPythiumultimumTrow.Keywords:peanut;Pythium;rootrot;identification近年来,随着种植花生经济效益的不断提高,山东省的花生种植面积也在不断增长，目前主要划分的两大优势区域，一是以种植春花生为主的胶东半岛、鲁中和鲁东南地区的29个县；二是以种植夏花生为主的鲁西和鲁西南地区黄河故道的5个县。其中花生腐霉根腐病是影响山东花生产量的主要因素之一，由于种植面积大，产区集中，连作面积广，给花生生产造成了很大危害。花生根部病害调查分离时，我们从以上大部分地区的花生病株中分离到了腐霉菌（Pythiumsp），为了明确山东省花生腐霉根腐病的病原特征及生物学特性，为防治提供依据，作者于2007-2009年度对山东花生腐霉根腐病病原进行了研究,结果报道如下。1材料与方法1.1症状表现调查方法对山东地区不同花生产区的花生进行田间病害调查并采集发病样本，记录花生从播种到收获是否能受到腐霉的侵染而发病，被害植株是否萎蔫，须根的腐烂情况以及初生根、次生根和主根的尖端是否特别容易受害，根系是否完全被破坏[1]。1.2病原菌分离与纯化方法将从田间采集的病株须根系用自来水冲洗干净,用吸水纸吸干表面的水珠,将病株须根系剪成长5mm的小块,将其放置于VP3选择性培养基中[2]25℃培养。24h后不断观察，发现有腐霉长出立即转移到CMA培养基上放在25℃恒温箱中培养，纯化，转入CMA斜面培养，5d后菌丝长满，放入4℃冰箱保存备用。1.3病原菌致病性测定方法按照柯赫法则[3]，采用盆栽接种测定方法测定病原菌的致病性，将土壤灭菌后装花盆，种花生(花育22)，花生团棵后，把4℃保存的菌种在CMA培养基上25℃扩繁，长满菌丝后按4%（菌：土）的接种量，与花盆内的土壤混匀，保湿筒保湿48h后调查发病情况，调查持续一周，从病组织分离回接菌种，并作单菌丝培养。1.4病原菌种类鉴定方法1.4.1病原菌最适温度及pH值测定将PDA培养基制成平板。将事先培养好的直径5mm的病菌圆饼转接在平板中央，分别置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃进行病原菌最适生长温度测定。在将PDA培养基的pH值调至3-12，按照上述方法将接好菌饼的培养皿置于25℃恒温培养箱内培养，定期观察，记录菌落生长速率以及菌落形态特征。1.4.2病原菌形态观察将腐霉菌在CMA平板培养基上培养，3d后移取边缘菌丝至皮氏（Petri）培养液中，25℃培养1～3d挑取孢子囊，观察孢子囊形态，有无层出现象，游动孢子的游出方式，并且测量孢子囊大小。待出现藏卵器、雄器、卵孢子后，观察藏卵器、雄器的形态，着生位置，配合情况及卵孢子的形态特征，每项指标分别观察测量100个，并且测量其大小，计算平均值[4]。鉴定则依据孢子囊、藏卵器、雄器、卵孢子的形态特征，大小及其特性来鉴定，主要参考《中国真菌志》（第六卷，科学出版社，余永年主编）进行鉴定[5]。1.4.3病原菌ITS序列测定将事先用CMA平板培养好的病原菌的菌落刮取下来，利用Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，而后利用通用引物(ITS1、ITS4)进行PCR扩增，最后利用Biospin胶回收试剂盒进行回收并测序[6]。鉴定则参照NCBI(美国国立生物技术信息中心)中的ITS序列，利用DNAstar等相关软件进行相似序列比对。2结果与分析2.1症状表现田间调查我们发现，鲁东南地区的莒县、莒南县花生根腐病害较为严重；而鲁中地区的宁阳县花生茎腐病和根腐病造成了花生的大面积减产；胶东半岛的招远则以根腐病、白绢病为主；鲁西和鲁西南地区的茌平、鄄城和济阳苗期主要以茎腐病为主，中后期则以根腐病为主。2.2分离、纯化出病原菌从莒县、宁阳县、济阳县、茌平以及招远等地共采集花生病株145株，利用VP3选择性培养基分离病组织672块，腐霉菌、镰刀菌、色二孢、杂菌出现的频率分别为38.1%、34.7%、21.7%和5.5%，在上述地方采集病根和病土，用黄瓜诱捕的方法分离351块，腐霉菌、镰刀菌、色二孢、杂菌出现的频率分别为65.5%、8.8%、24.5%和1.2%。表1VP3培养基分离病原菌比例Table1TheproportionofseparatedpathogenicfungiofVP3地点Site块数Number腐霉菌Pythium镰刀菌Fusarium色二孢Diplodia其它杂菌Otherfungi莒县1765573408宁阳226126955济阳131252581茌平79243124招远6026925合计67225623314637表1黄瓜诱捕法分离病原菌比例Table2TheproportionofseparatedpathogenicfungiofCucumberTrapping地点Site块数Number腐霉菌Pythium镰刀菌Fusarium色二孢Diplodia其它杂菌Otherfungi莒县103731020宁阳776611济阳10151941茌平17170招远53231254合计35123031864从上表1和表2可以看出腐霉菌的出现频率最高，利用水琼脂培养基对疑似腐霉菌进行了纯化培养，得到纯化培养物。经过病原菌形态观察以及ITS序列测定，初步确定这些病原菌为腐霉（Pythiumsp）。2.3病原菌的致病性测定随机调查接菌四种不同腐霉的盆栽花生各8株，结果表明，在盆栽接菌群结腐霉、旋柄腐霉、畸雌腐霉以及终极腐霉3天后，大部分花生表现出典型的田间发病症状，对照植株则生长正常。发病率依次是畸雌腐霉群结腐霉旋柄腐霉终极腐霉（见表3）。通过对病变组织内病原菌的重新分离以及显微观察测量鉴定，新分离病菌与原接种病菌相同，表明这些腐霉菌株为花生的致病菌。表3花生致病性测定Table3Determinationofpathogenicityofpeanutplants菌株采集地Straincollectionsites接菌种类Speciesofinoculation发病率Morbidity病情指数Diseaseindex宁阳P.ultimum81.82％37.66济阳P.myriotylum88.89％66.67招远P.helicoides83.33％52.38莒县P.irregulare100.00％42.862.4病原菌的种类鉴定结果表明：这些菌株为腐霉菌属的群结腐霉（PythiummyriotylumDrechsler）、旋柄腐霉（PythiumhelicoidesDrechsler）、畸雌腐霉（PythiumirregulareBuisman）以及终极腐霉（PythiumultimumTrow）。试验结果表明：4种腐霉病原菌最适生长温度介于25℃-30℃之间，低于5℃和高于36℃菌丝生长缓慢；4种腐霉病原菌最适pH值介于6-7之间。2.4.1不同采集地腐霉形态学鉴定如图PythiummyriotylumDrechsler菌落形态：菌落在CMA上无特定形态，菌丝发达，分枝，粗3.9～9.0μm。孢子囊由膨大与不膨大菌丝构成，膨大部分指状或裂瓣状，顶生或间生；游动孢子肾形，双鞭毛。藏卵器球形或近球形，直径24－31.5（平均28.3）μm，平滑。顶生或间生。雄器棒状或钩状，着生于分枝的雄器柄顶端，与藏卵器接触，每个藏卵器有多个雄器，卵孢子球形，直径21－29（平均26.3）μm，平滑，不满器，偶有满器，壁厚1.5－2.0（平均1.76）μm，内含贮物球和折光体各一个。（图4）图4群结腐霉的形态Fig.4MorphologyofPythiummyriotylum1-2孢子囊3泡囊4-5泡囊破裂产生游动孢子6休止孢子7休止孢子萌发产生芽管8-9藏卵器、雄器和卵孢子标尺=10μmPythiumhelicoidesDrechsler菌落形态：菌落在CMA上呈放射状，气生菌丝棉絮状。菌丝发达，粗3.5～5.2µm，分枝繁茂。孢子囊梨形、倒卵形，较少近球形，具有一乳突，顶生或间生，近球形孢子囊直径为18.2～36.7（平均28.6）µm，梨形孢子囊为20.5～38.2µm×19～32.5µm；孢子囊有孢囊层出现象，常常在孢子囊内部层出2～3层。藏卵器球形，直径28.6～43.2（平均37.5）µm，平滑，多数为顶生，少数切生。雄器较大，整个附着在藏卵器上，多橘瓣状，少数棍棒状，少数边缘不规则，卵孢子球形，直径22－32（平均27.8）μm，平滑，不满器。（图5）PythiumirregulareBuisman菌落形态：菌落在CMA上呈放射状，菌丝发达，不规则分枝，粗1.8～7.7µm，孢子囊梨形、柠檬形，或近球形，顶生或间生，12～图5旋柄腐霉的形态Fig.5MorphologyofPythiumhelicoides1-2孢子囊3孢囊层出4-6藏卵器、雄器和卵孢子标尺=10μm图6畸雌腐霉的形态Fig.6MorphologyofPythiumirregulare1-2孢子囊3-7藏卵器和雄器8-9卵孢子标尺=10μm25（平均23.4）µm，藏卵器球形，多间生，偶有顶生，15～25（平均20）µm，藏卵器壁上常有多个突起。雄器多与藏卵器同丝生，常无柄，卵孢子球形，平滑，单生偶有双生，不满器，11～22（平均17.1）µm，内含贮物球和折光体各一个。（图6）PythiumultimumTrow菌落形态：菌落在CMA上呈放射状，菌丝发达，分枝繁茂，粗3.3～9.8µm，菌丝膨大体近球形，多间生，14～32（平均23.4）µm，藏卵器球形，平滑，多顶生，少间生，直径13～30（平均20）µm，雄器多紧靠藏卵器形成，受精管明显可见，粗约1.5µm，卵孢子球形，平滑，不满器，10～25（平均19.2）µm，内含贮物球和折光体各一个。（图7）2.4.2分离腐霉测序结果及同源性比较图8分离不同地区腐霉菌株基于ITS序列的系统发育树状图Fig.8PhylogenetictreebasedonITSsequencesofPythiumcollectedfromdifferentareas图7终极腐霉的形态Fig.7MorphologyofPythiumultimum1-3菌丝膨大体4-5藏卵器和雄器6卵孢子标尺=10μm在形态学鉴定的基础上，用Blast对所分离腐霉菌株的ITS序列与GenBank中已有的ITS序列进行比