紫草细胞悬浮培养

紫草细胞培养紫草及紫草宁紫草（学名：Lithospermumerythrorhizon），别名山紫草、紫丹，是紫草科紫草属植物，多年生草本，高达90厘米。多生长在山坡草地，目前尚未由人工引种栽培。紫草是一种重要的药用植物，其根部富含红色的萘醌类次生代谢产物-紫草宁及其衍生物。它们具抗、消炎、活血、诱导癌细胞凋亡和抑制1型HIV病毒等功效，同时也是一种天然的染料。紫草细胞中对羟基苯甲酸和焦磷酸香叶酯由羟基苯甲酸香叶基转移酶催化生成香叶基-对羟基苯甲酸，后经一系列反应在内质网中形成紫草宁，并通过胞外分泌作用将形成的紫草宁微粒运输到原生质体外的细胞壁中。紫草根CH3CH3COOHOCHCH2CHHOHO紫草素紫草宁又称紫草素，为赤褐色针状晶体(由苯重结晶)天然色素，绛红色。抗菌、抗炎、抗病毒、止血。用于化妆品生产现状紫草是我国传统中药材，多家中药饮片厂以紫草为主要原料研制开发生产了约500多种（规格）中成药、特药、新型中药，以及几十种中药饮片。这些产品投入市场后很受消费者欢迎，销量增加，对紫草的需求量也随之逐年大幅攀升。然而市场提供的紫草几乎完全是野生品。由于大规模地滥采乱挖，已造成野生资源枯竭。那么，应用植物组织培养技术生产紫草素成为了解决问题的重要手段。硬紫草组织培养前期研究表明,紫草细胞中紫草素的生物合成属非生长偶联型（产物只有在细胞生长停止时才能合成）,而且细胞生长和紫草素合成所使用的培养基也不同,因此采用二阶段培养法。第一阶段为愈伤组织继代培养。B5基本培养基中添加吲哚乙酸(IAA)0.025mg/L，6-苄基腺瞟呤(6一BA)1.Omg/L，光培养。光照时间6—8小时／天。第二阶段为细胞悬浮培养形成紫草宁发其衍生物，M9基本培养基改加吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L，6-苄基腺瞟呤(6-BA)1.Omg/L，Ca(NOa)2·4H2O347mg/L，CuCl2·H2O6.Omg/L。培养18天的愈伤组织按种到内装5OmlM9培养液的50ml三角瓶中，置于旋转式摇床上培养，转速120r/min，振幅2.5cm。悬浮细胞暗中培养20天收获。硬紫草悬浮培养时细胞的生长曲线如图-1所示，细胞数量随着时间的变化曲线呈现S形。在细胞接种到培养基中最初的时间内细胞很少分裂，经历一个延迟期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期，接着是细胞增殖减慢的的减慢期和停止生长的静止期。整个周期经历时间的长短植物种类和起培养细胞密度的不同而不同。在细胞培养过程中，一般在静止期或静止期前后进行继代培养，具体时间可根据静止期细胞活力的变化而定。图-1悬浮培养时细胞的生长曲线0培养时间（d）细胞数静止期减慢期直线生长期对数生长期延滞期由于悬浮培养具有：增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；可带走培养物产生的有害代谢产物，避免有害代谢产物局部浓度过高等问题；保证氧的充分供给等三个基本优点，使悬浮培养细胞的生长条件比固体培养有很大的改善。接种后第三天左右，细胞团边缘变红，表明紫草宁及其衍生物开始形成；细胞指数生长期，紫草宁及其衍生物的量稳步上升；在静止期，紫草宁及其衍生物形成速度加快；培养细胞20天后紫草宁及其衍生物百分含量达到最高水平。20天后继续培养，紫草宁及其衍生物量缓慢下降上述实验结果表明，紫草细胞悬浮培养紫草宁及其衍生物的形成与细胞生长呈负相关，细胞生长缓慢则有利于目的产物的形成。其细胞生长与产物形成的动态变化类型，是非生长偶联型，因此硬紫草细胞大规模培养应采用成批培养或者固定化培养形式。植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较生产方式收获时间紫草宁浓度（%干重）完整植物2-3a1-2植物细胞培养21d14固定化培养紫草细胞合成的色素主要存在于细胞内,同时有部分外泌到细胞外,约占总量的30%,只有外泌的色素可以收集利用。为增加紫草色素外泌量,吕华等采用固定化培养法,以B5培养基为基本培养基,固定化培养的细胞生长缓慢,第30天时的相对生长量为70%,仅为琼脂培养基上生长的愈伤组织的1/6,但细胞能保持分裂达50天。色素产量达到4.2mg/gFW,相对色素外泌量达70%,而悬浮培养细胞仅有30%。可见固定化细胞具有较强外泌能力。随着细胞内色素积累产生反馈抑制作用,不利于固定化培养的连续进行。因此有必要采用促进产物释放的技术,研究表明:以正十六烷处理固定化细胞,可促进产物释放,连续培养的固定细胞保持其色素形成能力达80天之久,色素总产量达20mg/gFW,高于悬浮细胞。国内也有学者报道在固定化或半连续培养中加入丙二醇也可增加紫草宁及其衍生物释放到培养基中,但紫草悬浮培养细胞中直接加入聚氨基甲酸乙酯泡沫能增加紫草宁及其衍生物得率,可达到95%以上。紫草细胞合成紫草宁的影响因素1.pH值对紫草细胞合成紫草宁的影响方德秋等人研究了pH值对新疆紫草悬浮培养细胞生长及紫草宁衍生物合成的影响。发现在pH=5.0-6.2范围内，新疆紫草细胞生长旺盛，尤以pH5.6为最。而且在一定的pH范围内，生产培养基的初始pH值对悬浮培养细胞中紫草宁衍生物含量的影响不大。2.激素对紫草细胞合成紫草宁的影响细胞分裂素类对紫草宁衍生物的合成有抑制作用,且这种作用随使用浓度的增加而加强，但是一定浓度的细胞分裂素对细胞的生长有促进作用，因而有一个最适添加量。NAA和IBA会明显的抑制紫草宁的合成，低浓度的IAA既能促进细胞生长又有利于紫草宁的合成。3.Ca2+/CaM对紫草细胞合成紫草宁的影响研究发现Ca2+/CaM信号分子可能参与了对滇紫草细胞中紫草宁形成的调控，对紫草宁的产量有十分显著的影响。合适的钙源浓度能够促进紫草宁的生成。4.添加前体物质对紫草细胞合成紫草宁的影响胡立勇研究了不同配方的培养基对紫草宁产量的影响，发现培养基中添加L-苯丙氨酸（合成紫草宁的前体物质）对紫草素形成有明显刺激作用。小结应用植物细胞培养技术生产天然产物,可以克服某些天然资源紧缺的药用植物及一些易受自然环境或病虫害影响的药用植物。至今为止,国内已成功的利用组织培养技术大规模生产洋地黄、丹参、人参、黄芪等药用植物,可以预见不久的将来,植物组织培养技术将是生产名贵中草药和市场紧缺药材的重要手段之一。EndThankyou