《药物分析》第6章：药物的含量测定方法[1]

第6章药物的含量测定方法化学分析法重量分析容量分析含量测定仪器分析法效价测定（生物学法）紫外高效液相色谱法气相色谱法19:46第1节容量分析法（滴定法）1.滴定分析：是将一种已知准确浓度的标准溶液滴加到被溶液中，直到化学反应完全为止，根据标准溶液的浓度和体积求得被测组份含量的一种方法。在进行滴定分析时：一方面要会配制滴定剂溶液并能准确测定其浓度另一方面要准确测量滴定过程中所消耗滴定剂的体积19:46⑴滴定：将滴定液从滴定管滴加到被测物质溶液中的过程⑵化学计量点：滴加的标准溶液与待测物质按照一定的化学反应式定量反应完全之点⑶滴定终点：在滴定过程中，指示剂正好发生颜色变化的转变点。⑷指示剂：能够指示终点变化的试剂。⑸滴定误差：滴定终点与化学计量点不一定恰好符合，它们之间存在着很小的差别，由此引起测定结果的误差称为滴定误差。（6）标准溶液已知准确浓度的溶液（mol/L）19:462.滴定液的配制和标定基准物质：能用来直接配制标准溶液的化学试剂滴定度：每毫升标准溶液相当于被测物质的质量（g或mg），以符号T表示直接法（不需标定）间接法（标定）：先将其配制成近似于所需浓度的溶液，然后利用基准物质或另一种标准溶液来确定其准确浓度。19:46标定：用基准物质或标准溶液准确测定滴定液浓度的过程。校正因子（F）：表示滴定液准确浓度与标示浓度的比值。其范围应在1.05～0.95之间，超出该范围应加入适当的溶质或溶剂予以调整，并重新标定。19:46标定注意事项：a.操作中所用的天平、滴定管、容量瓶和移液管均应校正合格的。b.标定工作应在室温（10℃～30℃）下进行，并记录标定时的温度。c.根据滴定液的消耗量选用适宜的滴定管，盛装滴定液前，先用少量滴定液淋洗三次，盛装滴定液后，应用小烧杯盖住管口。d.标定中的空白试验，是指在不加供试品或以等量溶剂代替供试液的情况下，按同法滴定所得的结果。e.标定工作应由初标者和复标者在相同条件下各做3份平行试验，3份平行试验结果的相对标准偏差（RSD）不得大于0.1%；初标者的平均值和复标者的平均值的相对标准偏差（RSD）也不得大于0.1%；最后结果按初、复标二者的平均值计算，取4位有效数字。f.配制后的滴定液按药典规定的贮藏条件储存，并在瓶外贴上标签，注明滴定液名称、标示浓度、真实浓度或F值、配制和标定日期、标定时的温度、配制者、标定者、复标者等。g.当滴定液标定时间过长（一般不超过3个月）、或标定与使用时的温度超过10℃时，应加温度补偿值或重新进行标定，。h.当滴定液出现浑浊或其他异常情况时，不得使用。倒出剩余的滴定液不得再倒回原瓶，避免污染。19:463.滴定的分类按反应方式分类：直接滴定法：滴定液与被测物质直接反应间接滴定法：包括剩余滴定和置换滴定%1001000WTFV%1001000WTFV%1001000WTFV含量%=含量%=%1001000)(0WTFVV19:46按反应类型分：酸碱滴定：在水溶液中以酸碱中和反应来测定物质含量的方法配位（络合）滴定法：以形成稳定配合物的配位反应为基础的滴定分析法。用于金属离子的测定采用金属指示剂（如铬黑T），如EDTA（乙二胺四醋酸二钠）氧化还原滴定法：碘量法：如碘滴定液、硫代硫酸钠滴定液、淀粉指示剂铈量法：以硫酸铈[Ce（S04）2]作为滴定液、邻二氮菲作指示剂亚硝酸钠滴定法：溴量法：Na2S2O3滴定液、Br2滴定液19:46沉淀滴定法：以沉淀反应为基础，多以硝酸银为滴定液，也称银量法。按所用指示剂的不同分为铬酸钾指示剂法铁铵矾指示剂法吸附指示剂法非水滴定法：在非水溶剂（有机溶剂与不含水的无机溶剂）中进行滴定分析的方法。非水碱量法：是以冰醋酸为溶剂，高氯酸为滴定液，甲紫微指示剂，测定弱碱性药物及其盐类非水酸量法：是在碱性溶液中，以甲醇钠为滴定液，麝香草酚蓝为指示剂，二甲基甲酰胺等为溶剂，滴定弱酸性药物19:46第2节分光光度法分光光度法:是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。光是电磁波,常用的波长范围为：(1)200～400nm----紫外光区；(2)400～760nm----可见光区；(3)760～2500nm（12800cm-1～4000cm-1）----近红外光区（4）2.5～25μm（按波数计为4000cm-1～400cm-1）----红外光区。19:46紫外-可见分光光度法物质吸收紫外和可见光区的电磁波产生的吸收光谱进行定性和定量分析的方法1.基本原理：朗伯─比耳定律A为吸收度；T为透光率；L为液层厚度，单位为cm；E为吸收系数，常用的是百分吸收系数()，其物理意义为当溶液浓度为1％(g/ml)，液层厚度为1cm时的吸收度值；C为100ml溶液中所含被测物质的量g（按干燥品或无水物计算）ECLTIgA1ECLTIgA119:462.仪器的基本结构光源：200～400nm为紫外光区（氘灯）、400～850nm为可见光区（钨灯）3.仪器的校正和检定（1）波长的准确度（2）吸收度的准确度（3）杂散光的检查光源单色器吸收池检测器数据记录处理19:464.吸光度的测定《中国药典》2010版对吸光度的测定做了以下要求：（1）溶剂：（2）空白试验校正：（3）测定波长的检查（4）供试品溶液的浓度：应考虑使吸光度在0.3～0.7范围内（5）狭缝宽度的选择19:465.应用（1）鉴别和检查：比较吸收光谱的特征参数、吸光度比值、吸收光谱的一致性（2）含量测定：a.对照品比较法：b.吸收系数法：c.标准曲线法：借助电脑的Excel电子表格计算%100%VMACA样对对样稀释倍数含量%100100100%11样品样品稀释倍数稀释倍数MVLEAMVCcm含量%=19:466.注意事项（1）空白溶液与供试品溶液必须澄清，不得有浑浊。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。（2）测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池。（3）在测定时或改测其它检品时，应用待测溶液冲洗吸收池3～4次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损），放入样品室每次方向应一致。（4）取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。若吸收池内外壁沾污，用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇，轻轻擦试，再用纯化水冲净。（5）务必注意经常保持硅胶的干燥，目的是保护光学元件和光电放大器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作。（6）仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度，并应经常校准波长精度。19:46第3节色谱分析法色谱法的分离过程：是被分离组分在互不相溶的两相间分配平衡的过程，由于混合物中各组分的分配系数不同，或被吸附剂吸附能力的不同，则被流动相携带移动的速度也不同，达到分离的目的。液相色谱法：以液体为流动相气相色谱法：以气体为流动相19:46一、高效液相色谱法高效液相色谱法：采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱将待测组分进行分离测定的色谱方法。化学键合相色谱：最广泛的将固定相的官能团键合在载体上，形成的固定相，一般属于分配色谱法，不易流失19:46（一）基本概念：1.色谱图：信号---时间曲线2.基线：无样品时，用流动相冲洗检测出的流出曲线，一般平行于时间轴3.噪声：基线信号的波动4.漂移：基线随时间的变化5.色谱峰：6.拖尾因子：衡量色谱峰的对称性，应为0.95-1.057.峰宽：8.半峰宽9.标准偏差10.峰面积11.保留时间12.理论塔板数（柱效）：表示色谱柱的分离效率19:46（二）基本原理待分离物质在两相间进行分配时，在固定相中溶解度较小的组分，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定相中溶解度较大的组分，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。依固定相与流动相极性的不同，分为正相色谱和反相色谱1.正相色谱法流动相极性小于固定相一般用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相，主要用于分离极性化合物，极性小的组分先流出，极性大的组分后流出。2.反相色谱法流动相极性大于固定相一般用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相，主要用于分离非极性或弱极性化合物，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。19:46（三）固定相和流动相1.固定相常用化学键合相，分极性和非极性键合相，如十八烷基硅烷键合硅胶（C18或ODS）和辛基硅烷键合硅胶（C8）为最常用的非极性键合相，用于反相色谱法；氨基和氰基硅烷键合相为常用的极性键合相，用于正相色谱法。2.流动相有机溶剂+水混合一般为色谱纯试剂，经0.45um的微孔滤膜过滤，需脱气处理19:46（四）仪器的基本结构19:46日本岛津液相色谱仪19:461.色谱柱柱管-不锈钢，填充硅胶和化学键合固定相内径4.6mm长15cm、20cm和25cm的三种，如安捷伦色谱柱、迪马色谱柱、迪马钻石柱等。19:46色谱柱的维护1.最好使用预柱保护分析柱；2.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围；3.避免流动相组成及极性的剧烈变化；4.样品要采用0.22或0.45μm滤膜过滤，流动相采用0.45μm滤膜过滤并脱气；5.每次做完分析，要进行冲洗：分析用流动相中若无酸、碱、盐类物质，建议用90％甲醇冲洗30～60min；如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，要先用10％甲醇冲洗1小时左右，再梯度走到90％甲醇冲洗30～60min（若用多元泵）。若长时间不用该色谱柱，要冲洗好后，用纯甲醇或乙腈封存；6.若流动相中用到离子对试剂，更应该好好冲洗，且该色谱柱最好作为专用，不能再做其它物质分析用；7.普通C18柱尽量避免在40℃以上的温度下分析；8.压力升高是需要更换预柱的信号。19:462.检测器常用紫外检测器其次有二极管阵列检测器(DAD)荧光检测器示差折光检测器蒸发光散射检侧器电化学检测器和质谱检测器等19:46（五）系统适用性试验定义：指用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。包括理论板数分离度重复性拖尾因子等19:461.理论板数(N)：说明分离过程，色谱柱的塔板数越多，柱效越高2.分离度(R)：应大于1.53.重复性：相对标准偏差应不大于2.0%4.拖尾因子(T)：符合规定19:46（六）在杂质检查和含量测定中的应用1.内标法RRcAcsAsf//)(校正因子scsAAfcXX'/')(含量2.外标法RXRXAAcc)(含量19:46进样操作19:463.加校正因子的主成分自身对照法（测定杂质含量）4.不加校正因子的主成分自身对照法（无杂质对照品）5.面积归一化法（只能用于粗略考察供试品中的杂质含量）19:46二、气相色谱法1.分离原理注入进样口的样品经加热气化后，被载气带入色谱柱，由于其分配系数的不同进行分离，各组分先后进入检测器，信号记录仪、积分仪和数据处理系统记录色谱信号。分配系数小的组分先流出，分配系数大的组分后流出。19:462.色谱仪的基本结构由载气源、进样器、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统组成19:461.载气（流动相）：如氦、氮和氢等2.进样器：直接进样或顶空进样微量注射器19:463.固定相和载体色谱柱为填充柱或毛细管柱常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。*新填充柱和毛细管柱在使用前需老化以除去残留溶剂及低分子量的聚合物，色谱柱如长期未用，使用前应老化处理，使基线稳定。19:46毛细管柱和填充柱19:464.检测器火焰离子化检测器（FID)、热导检测器(TCD)、氮磷检测器（NPD)、火焰光度检测器(FPD)、电子捕获检测器(ECD)、质谱检测器(MS)19:46有机溶剂的气相分离图谱19:463.色谱系统适用性试验同高效液相色谱法4.在杂质检查和含量测定中的应用（1）内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量（2）外标