第四章 检验指标

本章提要第一节食品中菌落总数的测定第二节食品中大肠菌群的检验第三节致病性微生物的检验第四节其他食品微生物检验指标食品在食用前的各个环节中，被微生物污染是不可避免的。评价食品被微生物污染的程度，要采用微生物检验指标进行测定与评价。常用的微生物检验指标为三项，即细菌总数（主要是菌落总数）、大肠菌群最近似数和致病菌的检测。第一节食品中菌落总数的测定一、菌落总数•菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是数以万计相同的细菌集合而成。•细菌数量的表示方法：菌落总数、细菌总数•菌落总数：指一定数量或面积的食品样品，经过处理，在一定条件下培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，所得1g或1mL或1cm2检样中所含细菌菌落数量，常用CFU（菌落形成单位，clonyformingunit）表示。•按照国家标准方法规定，即在需氧条件下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板细菌菌落上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此，菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分细菌的种类。•细菌总数：指在一定数量和面积的食品样品，经过适当的处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数，其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。二、菌落总数的卫生学意义1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量食品中细菌数量越多，说明食品被污染的程度越重、越不新鲜、对人体健康威胁越大。在我国的食品卫生标准中，针对各类不同的食品分别制定出不允许超过的数量标准，借以控制食品污染程度。2、预测食品存用的期限长短食品中细菌数量越少，食品存放的时间就越长。如菌落总数为105cfu/cm2的牛肉在0℃时可存放7天，而菌落数102cfu/cm2时同样条件下可存放18天。三、菌落总数测定的方法※平板倾注法＃平板表面涂布法平板表面点滴法四、平板倾注法测定菌落总数1、检验步骤(程序)：检样→稀释处理→做平板→培养→菌落计数→报告结果1）检样稀释与培养•以无菌操作，将检样25g剪碎后，放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液中，充分振摇，制成1：10的均匀稀释液。固体样品加入稀释液后，最好用灭菌的均质器以8000-10000r/min的速度处理1min。•用1mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液中，振摇，混合均匀，制成1：100的稀释液。•另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1mL灭菌吸管。•根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2-3个适宜的稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该样品稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。•稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃的营养琼脂培养基注入平皿12-20mL，并转动平皿使其混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入1mL不含样品的稀释液中作空白对照。•待琼脂凝固后，翻转平皿，置于（36±1）℃恒温培养箱内培养（48±2）h。培养条件：普通食品：37℃，48h清凉饮料、调味品、糕点、酒类：37℃，24h水产品：30℃，48h•平板菌落计数法测定食品中的菌落总数，一般采用中温培养，是因为这些食品卫生的要求是严格防止消化道传染病原菌和食物中毒病原菌的污染，这些病原菌都属于嗜温性菌，因而测定细菌数时采用中温培养是比较合理的。样品稀释及倾注平板1mL1mL1mL1mL1:101:10001:1001:100001mL1mL1mL加入46℃营养琼脂12-20mL25g/mL样品生理盐水2）菌落计数和报告到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板的平均菌落数。计算出原始样品中每g（mL）中的菌落数，进行报告。平板菌落的选择（1）选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定的标准。一个稀释度使用两个平皿，应选择两个平板的平均数。（2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。稀释度的选择（1）选取菌落数在30～300之间的平板，若有二个稀释度均在30～300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则报告其中稀释度较低的平皿菌落数。（2）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告。（3）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告。（4）如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告。（5）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。菌落数的报告1）菌落数在1～100时，按实有数字报告。2）如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为缩短零的个数，以10的指数表示。3）固体检样以克（g)为单位报告，4）液体检样以毫升（mL）为单位报告，5）表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。2、检验注意事项1）对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2）吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；3）进行稀释时，吸管口不得与稀释液接触;4）为防止细菌增值及形成片状菌落，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min。5）稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。思考检验某食品样品中的菌落总数时，10-2、10-3、10-4稀释度的平均菌落数分别为201、50、15，则样品中的菌落总数为多少？第二节食品中大肠菌群的检验一、大肠菌群的定义与组成1、大肠菌群的定义指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。2、大肠菌群的组成埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和肠杆菌等。1、以大肠菌群作为粪便污染指示菌原因1)在粪便中数量极高；2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；3)检测方法简便容易。二、大肠菌群的测定意义粪便污染的指示菌：大肠菌群或大肠杆菌。2、大肠菌群的测定意义（1）判断食品是否受到粪便污染。（2）有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。三、大肠菌群的生物学特性形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽孢杆菌。革兰氏染色及EMB平板照片发酵乳糖产酸产气。培养特性：1、在伊红美兰(ＥＭＢ)琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；麦康凯琼脂平板Ageofcultureis24h2、在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。大肠杆菌平板菌落照片肠杆菌扫描电镜照片.四、大肠菌群数量的表示方法以每100g或100mL检样中大肠菌群最近似数（MPN)来表示。MPN是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值。五、大肠菌群检验方法及操作方法1、检验方法：国家标准：三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)我国统一采用一个样品，三个稀释度各接种3个管，乳糖发酵、分离培养、复发酵试验，然后根据大肠菌群MPN检索表报告结果。2、培养基与试剂75%乙醇、生理盐水、乳糖-胆盐发酵管、伊红美兰（EMB)培养基、乳糖发酵管、革兰氏染色液等。检样稀释处理EMB平板革兰氏染色乳糖发酵管革兰氏阴性无芽孢产气革兰氏阳性大肠菌群阴性大肠菌群阴性报告不产气乳糖胆盐发酵管产气不产气大肠菌群阴性报告报告报告大肠菌群阳性3、检验程序4、操作方法1）采样及稀释以无菌操作，将检样25g（mL）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液中，充分振摇，制成1：10的均匀稀释液。固体样品加入稀释液后，最好用灭菌的均质器以8000-10000r/min的速度处理1min。用1mL灭菌吸管吸取1：10的稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液中，振摇，混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用一支1mL灭菌吸管。根据食品卫生要求或对样品污染情况的估计，选择3个相邻的稀释度，每个稀释度接种3管。2）乳糖初发酵实验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，每个稀释度接种3管，置于37℃培养24h。若所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则报告大肠菌群阴性；如有产气者，则接下试验。3）分离培养将产气的发酵管接种于伊红美兰平板上，置于37℃培养18-24h，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。4）乳糖复发酵试验（证实试验）挑取可疑菌落进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置于37℃培养24h，观察产气情况。凡发酵乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。5）报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL大肠菌群的MPN数。1:1001:10各加入1mL各加入10mL各加入1mL单料乳糖胆盐发酵管单料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管初发酵检样稀释检样量1g（mL）检样量0.1g（mL）检样量0.01g（mL）EMB分离培养证实试验乳糖发酵管镜检查MPN表报告结果1:1001:10各加入1mL各加入10mL各加入1mL检样量1g（mL）检样量0.1g（mL）检样量0.01g（mL）EMB思考:检样中的MPN?大肠菌群MPN检索表（部分）阳性管数MPN个/100g（mL）1g（mL）×30.1g（mL）×30.01g（mL）×3000＜30001300026000390110701111101121501131902206022190222120223150330903311303321603331901）对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。2）挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。3）胆盐可抑制样品中的一些杂菌，有利于大肠菌群的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也有抑制作用。不可用其他胆盐代替指定的胆盐。5、检验注意事项六、大肠菌群快速检验•TTC(2、3、5——氯化三苯四氮唑)显色法•疏水网膜法•DC（去氧胆酸钠）半固体试管法•纸片法DC（去氧胆酸钠）半固体试管法（1）选择三个稀释度的样品液，每个稀释度分别取1mL放入灭菌试管中。（2）将溶化并冷至50℃左右的DC半固体培养基加入上述试管中，每管3mL。立即混合，凝固后于37℃培养18－24小时。(3)判定标准和记录：a培养基变桔红色，有气泡产生或琼脂崩裂。记录为++；b培养基为桔红色，或有桔红色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为+；c培养基为绿色，有黄色菌落，无气泡和琼脂崩裂现象，记录为±；d培养基为绿色，记录为-。•(4)判定为a、d反应结果；记录阳性管数，查MPN表并报告之。•若为b、c反应结果，可挑大肠菌群可疑菌落接种乳糖复发酵管，根据产酸产气管数查MPN表，并报告之。食品饮料大肠菌群快速检验(纸片法)使用方法：1.样品稀释同国标法。2.接种：饮料和饮用水采用原液、1:10、1:100三个稀释度，固体食品采用1:1、1:10和1:100三个稀释度。用1亳升灭菌吸管吸取1亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。3.培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36℃下培养15－24h观察结果。4.结果判定:1)纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性。2)纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性。3)纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围没有黄圈者阴性。4)酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性。5)记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。餐