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低氧模拟剂氯化钴对胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达的影响王清洪制作学号：092406102摘要S100A4基因是肿瘤侵袭转移相关的重要基因,该基因高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关。为探讨S100A4基因高表达的机制,用低氧模拟剂氯化钴处理胃癌细胞BGC823,RT-PCR、免疫组化、免疫荧光及Westernblotting方法分别检测BGC823细胞中S100A4mRNA及蛋白表达情况。结果显示,氯化钴处理胃癌BGC823细胞后,S100A4mRNA及蛋白表达明显增加。提示低氧模拟剂氯化钴可促进胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达。低氧是实体肿瘤的共同特征,它是癌细胞快速增殖与血液供应相对滞后的结果。低氧引起肿瘤细胞生物学特性发生改变,如细胞侵袭、转移能力增加,并可能对放化疗产生耐受。低氧对细胞的影响主要通过调节基因表达而实现,因此研究低氧环境下转移相关基因的表达变化具有重要意义。S100A4蛋白是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一,可降低肿瘤细胞间黏附能力、促进细胞外基质水解和重塑、增强肿瘤细胞运动能力、促进血管生成等,在肿瘤侵袭转移过程中发挥关键性作用。现已证实S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关,但是目前关于S100A4表达调控的研究报道甚少。低氧是否可调节S100A4表达,尚未见报道。我们应用生物信息学软件在S100A4基因的调控区预测到低氧反应元件,推测微环境低氧可能上调S100A4基因表达。因此本实验观察了低氧模拟剂氯化钴处理对人胃癌细胞系BGC823中S100A4表达的影响,旨在研究微环境低氧对胃癌侵袭转移影响的机制,并探讨S100A4基因表达调控的新途径。材料和方法主要材料:BGC823细胞系;RPMI1640培养基、胎牛血清;氯化钴;兔抗人S100A4多克隆抗体;b-actin抗体;总RNA提取试剂Trizol;反转录试剂盒及PCR扩增试剂盒;PCR引物。细胞培养和低氧诱导:取低分化的人胃腺癌细胞系BGC823,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,另加青霉素(100U/mL)和链霉素(100mg/mL),37℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养。细胞生长至60%~70%融合度后,实验组加入含低氧模拟剂氯化钴(终浓度为100~500mmol/L)的培养基,对照组为正常培养基,继续培养24h后收集细胞。方法RT-PCR检测BGC823细胞中S100A4mRNA表达收集实验组和对照组细胞,应用Trizol提取总RNA,采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录合成cDNA,取反转录产物2mL进行PCR反应。S100A4引物序列:上游:5′-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3′;下游:5′-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3′。扩增片段长度为277bp,复性温度为58℃;内参照b-actin引物序列:上游:5′-CCAGATCAtGTTTGAGACCT-3′;下游:5′-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′。扩增片段长度为480bp,复性温度为58℃。循环条件:95℃预变性5min,94℃变性30s,58℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环,72℃延伸10min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳,LabWORKS凝胶图像分析系统分析扩增产物条带的光密度值,并通过S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值反映S100A4mRNA表达量的高低。Westernblotting检测BGC823细胞中S100A4蛋白表达收集实验组和对照组细胞,立即置于冰上,吸净培养基并以4℃预冷的PBS漂洗细胞1~2次,提取细胞总蛋白,以Bradford法作蛋白定量后,取50mg蛋白作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%积层胶,10%分离胶),电转膜后,加入兔抗人S100A4多克隆抗体(1︰1000)和羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,b-actin作为内参照,利用ECL显色试剂盒显色,应用图象分析仪测定条带光密度值,以S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值来反映S100A4蛋白表达的高低。免疫细胞化学及免疫荧光检测S100A4蛋白在BGC823细胞中的表达将BGC823细胞接种于玻片上,200mmol/L氯化钴处理24h后,取出玻片,4%甲醛固定。一抗为兔抗人S100A4多克隆抗体(1︰1000稀释),4℃孵育过夜。免疫组化采用北京中杉金桥生物技术有限公司SP检测试剂盒进行,DAB显色,光学显微镜下观察结果;免疫荧光二抗为FITC标记的鼠抗兔IgG(1︰2000稀释),室温孵育2h后荧光显微镜下观察结果。统计学分析采用SPSS统计软件进行检验,P0.05具有统计学意义。结果与分析•氯化钴对BGC823细胞S100A4mRNA表达的影响•氯化钴对BGC823细胞S100A4蛋白表达的影响•免疫组化和免疫荧光检测S100A4在BGC823细胞中的表达RT-PCR结果显示,不同浓度氯化钴处理24h后,BGC823细胞中S100A4mRNA表达改变如下:100mmol/L、500mmol/L氯化钴处理后,S100A4mRNA表达无明显变化,200mmol/L氯化钴处理后S100A4mRNA表达明显升高。采用200mmol/L氯化钴处理细胞重复实验3次,结果显示实验组mRNA表达(1.5567±0.2676)显著高于对照组(0.8267±0.1850)(P0.05),可见200mmol/L氯化钴处理可以使S100A4mRNA表达显著增高。氯化钴对BGC823细胞S100A4mRNA表达的影响氯化钴对BGC823细胞S100A4蛋白表达的影响Westernblotting结果显示,200mmol/LCoCl2处理24h后,S100A4蛋白表达明显增高,实验组S100A4蛋白表达(1.6633±0.3496)显著高于对照组(0.7300±0.1868)(P0.05)。免疫组化和免疫荧光检测S100A4在BGC823细胞中的表达免疫组化及免疫荧光结果显示,氯化钴处理后S100A4蛋白表达明显高于对照组。讨论近年来微环境低氧与肿瘤的关系倍受关注,低氧通过调控多种基因表达而影响肿瘤细胞的生物学特性。为探讨低氧对胃癌细胞中S100A4表达是否具有调控作用,本实验首先应用不同浓度低氧模拟剂氯化钴对胃癌BGC823细胞进行体外模拟低氧处理,RT-PCR结果显示:氯化钴处理后S100A4蛋白表达较对照组明显增高,表明微环境低氧可使胃癌细胞S100A4基因表达增高;而S100A4作为一种重要转移相关基因,其高表达可使胃癌细胞生物学特性发生变化,如侵袭转移等能力增加,因而促进胃癌的进展,可见S100A4是低氧对胃癌细胞影响的一个重要介导者。本研究首次证明低氧模拟剂氯化钴处理可以使胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达增高,该结果加深了低氧对胃癌侵袭转移影响分子机制的认识,同时也发现了S100A4基因表达调控的新途径-微环境低氧。该结果为胃癌侵袭转移的防治研究提供了重要科学依据,也为其他肿瘤的研究提供了新思路。参考文献•[1]GrahamCH,ForsdikeJ,FitzgeraldCJ,Macdonald-GoodfellowS.Hypoxia-mediatedstimulationofcarcinomacellinvasivenessviaupregulationofurokinasereceptorexpression.IntJCancer,1999,80(4):617-623.•[2]MazzuccheliL.ProteinS100A4:toolongoverlookedbypathologists.AmJPathol,2002,160(1):7-13.•[3]JenkinsonSR,BarracloughR,WestCR,RudlandPS.S100A4regulatescellmotilityandinvasioninaninvitromodelforbreastcancermetastasis.BrJCancer,2004,90(1):253-262.•[4]XueC,PliethD,VenkovC,XuC,NeilsonEG.Thegatekeepereffectofepithelial-mesenchymaltransitionregulatesthefrequencyofbreastcancermetastasis.CancerRes,2003,63(12):3386-3394.•[5]GrigorianM,AndresenS,TulchinskynE,KriajevskaM,CarlbergC,KruseC,CohnM,AmbartsumianN,CAnnette,SelivanovaG,LukanidinE.Tumorsuppressorp53proteinisanewtargetforthemetastasis-associatedMts1/S100A4protein:functionalconsequencesoftheirinteraction.JBiolChem,2001,276(25):22699-22708.•[6]KeirsebilckA,BonneS,BruyneelE,VermassenP,LukanidinE,MareelM,vanRovF.E-cadherinandmetastasis(mts-1/S100A4)expressionlevelsareinverselyregulatedintwotumourcellfamilies.CancerRes,1998,58(20):4587-4791.•(7)滑君,付浩,张瑞秀,陈丹琦,闫扬,陈芳杰,孙开来,孙秀菊,遗传2008Vol.30(12):1563-1566王清洪