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实验六：回收试验和干扰试验一、实验目的1．掌握GOD-POD法测定血糖的原理及临床意义。2．掌握回收试验的原理和方法。3．掌握干扰试验的原理和方法。二、实验原理1、GOD-POD法测血糖原理：葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放出过氧化氢。后者在过氧化物酶（peroxidase，POD）的作用下与色原性氧受体4-氨基安替比林偶联酚缩合成红色醌类化合物，即Trinder反应。该红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。2、回收实验原理将被测定物标准液加入病人标本中，作为分析样本；原病人标本中加入等量的无分析物的溶剂作为基础样本；用候选方法测定并得到各自浓度，计算回收浓度及回收率。通过测定GOD-POD法测血糖的回收率，能较确切地反映该分析方法比例系统误差的大小，从而对方法的准确性作出可靠评价。3、干扰实验原理：选用维生素C做GOD-POD法测血糖的干扰试验，维生素C可和GOD反应生成的H2O2发生反应，使部分H2O2不能参与第二步POD催化的偶联反应，从而降低显色强度，产生负的测定误差。1、主要器具微量移液器三、器材三用水浴箱722型可见光分光光度计计算器四、试剂1．血清标本含血糖2.2mmol/L的血清（回收实验用）含血糖6.7mmol/L的血清（干扰实验用）2．葡萄糖标准液（80mmol/L）3．GOD-POD法测定葡萄糖试剂盒4.1g/L、2g/L、3g/L维生素C溶液五、操作步骤1、回收样品制备基础样品：血清0.9ml+0.1ml蒸馏水回收样品Ⅰ：血清0.9ml+0.01ml80mmol/L葡萄糖标准液+0.09ml蒸馏水回收样品Ⅱ：血清0.9ml+0.06ml80mmol/L葡萄糖标准液+0.04ml蒸馏水回收样品Ⅲ：血清0.9ml+0.09ml80mmol/L葡萄糖标准液+0.01ml蒸馏水2．干扰样品制备基础样品：血清0.9ml+蒸馏水0.1ml。干扰样品Ⅰ：血清0.9ml+1g/L维生素C溶液0.1ml干扰样品Ⅱ：血清0.9ml+2g/L维生素C溶液0.1ml干扰样品III：血清0.9ml+3g/L维生素C溶液0.1ml3、按下表操作加入物(ml)BS回基回1回2回3干基干1干2干3DDW0.01—————————5.5mmol/糖标—0.01——————各个样品——0.010.010.010.010.010.010.010.01酶酚试剂1.51.51.51.51.51.51.51.51.51.5混匀，置水浴箱37℃，15分钟，505nm空白管调零，722型分光光度计分别测各管A值。六、结果计算（一）回收实验数据处理1．加入浓度计算：加入浓度(mmol/L)=2．回收浓度计算：回收浓度＝回收样品测得浓度－基础样品测得浓度3．回收率计算：回收率=×100%mlmlml标准液量病人样品量标准液量标准液浓度加入浓度回收浓度4．计算结果请填入表内：测定浓度加入浓度回收浓度回收率测定1测定2测定3平均浓度基础样品回收样品Ⅰ回收样品Ⅱ回收样品Ⅲ平均回收率（二）干扰实验数据处理1．干扰物加入浓度计算：干扰物加入浓度＝干扰物溶液浓度×2．干扰值计算：干扰值(mmol/L)＝干扰样品测定浓度－基础样品测定浓度3．干扰率计算：干扰率＝×100%)()(mlmlml干扰物溶液量血清量干扰物溶液量基础样品浓度干扰值4．计算结果请填入表内：测定浓度加入干扰物浓度干扰值干扰率测定1测定2测定3平均浓度基础样品干扰样品Ⅰ干扰样品Ⅱ干扰样品Ⅲ七、注意事项1．分析物浓度应选择在医学决定水平附近，通常设置高、中、低三个浓度的回收。2．纯标准品溶液的加入体积不得超过血清样品体积的10%，以避免将血清稀释过度，引起误差的改变或消失。3．加量是否准确对实验结果影响很大。1．干扰试验的对象有厂商研制的新产品；新建立的方法；新引进的方法或试剂。2．应做的主要干扰物：病人标本中常出现的黄疸、脂血和溶血；某些药物如维生素C等；实验常用的抗凝剂，防腐剂和稳定剂。3．可疑干扰物浓度加入可疑干扰物的浓度应明显高于通常所见浓度的上限，有可能时应达到病理标本的最高值。4．无论是方法特异性差或是受干扰，都影响到测定结果的正确性，影响的程度与与非分析物的量有关，所以产生的误差都是恒定系统误差，常以偏差Bias作为统计量。5．由某些物质引起测定结果的偏差，足以影响临床解释者谓之干扰，但各项测定的临床要求至今仍未确定，建议将该分析方法批内测定值±1.96s作为控制限度。八、方法学评价回收实验：一般检验方法要求回收率在95%～105%之间，最为理想的回收率应是100%。回收率接近100%，说明分析方法对于分析物无论在纯溶液中，还是在复杂的基体环境中，反应能力是一致的，分析物不受基体效应影响，若回收率明显偏离100%，说明分析物处于的基体环境不同，反应能力有明显差别。干扰试验：干扰试验的方法主要有“配对差异”试验及用病人标本作偏差分析。所谓“配对差异”试验，即将不同浓度的干扰物加入到实验标本中，然后分别测定加与不加干扰物的标本，比较二者有无偏差，并了解干扰物浓度与偏差的关系。所谓用病人标本作偏差分析即选择病人标本，如肝脏、肾脏或心脏疾病患者，用服用了某种可能有干扰的药物的病人标本，以及含有高胆红素，高血脂和血红蛋白的标本，用候选方法和参考方法同时测定，将两方法的测定结果进行比较，以确定某物质对候选方法是否有干扰及干扰程度。本次实验所选用的方法为“配对差异”试验。这两种干扰试验各有优缺点，第一种方法的不足之处是实验标本的介质可能与病理标本的介质不尽致，病理标本中的干扰物可能不是原来的药物，加入的干扰物可能与病理标本中的干扰物不完全相同。第二种方法的不足之处是①病人通常用多种药物，难以确定干扰物；②不是每种测定项目均有参考方法，而且有的参考方法难以在临床实验室中开展；③参考方法亦可能受某些物质的干扰。两种方法同时使用，会起互补作用。