高效液相色谱分析

复习2020/1/26•分离度R定义；•为什么可用分离度R作为色谱柱的总分离效能指标？•能否根据理论塔板数来判断分离的可能性？为什么？•根据“相似相容”原理，色谱的流出规律？•热导检测器适用范围与工作原理？色谱流出规律•分离非极性物质，一般选用非极性固定液，各组分按沸点次序先后流出色谱柱，沸点低的先出峰，沸点高的后出峰。•分离极性物质，选用极性固定液，各组分按极性顺序分离，极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱。•分离非极性和极性混合物时，一般选用极性固定液，这时非极性组分先出峰。•对于形成氢键的试样，如醇、酚、胺和水等，一般选用极性或氢键型固定液，各组分按与固定液分子间形成氢键能力大小先后出峰。2020/1/262020/1/262020/1/26第三章高效液相色谱分析法一、高效液相色谱法特点CharacteristicofHPLC二、影响色谱峰扩展及分离的因素Thefactorsthatinfluencepeakexpansionandseprationhighperformanceliquidchromatograph§3-1概述2020/1/262020/1/262020/1/262020/1/26经典LC与HPLC比较2020/1/26HPLC:采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器HPLC特点：高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便2020/1/26GC与HPLC的比较2020/1/26与GC比较，HPLC的优点1.分析对象广气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化合物；HPLC不受样品挥发性和热稳定性的限制，适用于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。原则上讲，几乎可以分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。2.流动相对分离起作用气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。3.经常在室温条件下操作气相色谱法一般在较高温度下进行2020/1/26缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。与GC相比，流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性2020/1/262020/1/26影响色谱峰扩展及分离的因素•基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离因子)、塔板理论及速率理论。•由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。2020/1/26速率理论(与GC对比)•GC:•HPLC:2020/1/26TDDdfCCCCCCCtBDDBdpdpLllllgsmRgmMTD或ηTDDB,22A2A)(uCB/uAH)(uCB/uAH2ggg毛细管柱填充柱相忽略大低，流动相柱温BTTDBuCAHmmD2速率理论(与GC对比)•讨论：•1）流动相流速对HPLC板高的影响(与GC对比)next•2）涡流扩散项及其影响next2020/1/26min/1/1mlutnHuuHscmuR选择兼顾柱效和分析时间，，但柱效，时，柱效，，nHAdpdpAdpA2速率理论(与GC对比)2020/1/26速率理论(与GC对比)•3）传质阻抗项及其影响2020/1/26，柱阻，，但易产生气泡柱效，柱效，：忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静）（忽略固定相传质阻抗mmmmmmsmmsmmsmmssmmDTCDTnHDnHCdpTDDdpCDdpCCuCuCAHHPLCCCCCCC22HPLC法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp≤10μm）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，1ml/min3.柱温的选择：选室温250C左右2020/1/262020/1/26第三章高效液相色谱分析法一、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph二、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph三、离子交换色谱ion-exchangechromatograph五、离子对色谱ion-pairchromatograph四、离子色谱ionchromatograph六、排阻色谱size-exclusionchromatograph§3-2主要分离类型与原理highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2020/1/26一、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。2020/1/26二、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatography固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2020/1/26三、离子交换色谱ion-exchangechromatography固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3-Na++M+=R—SO3-M++Na+阴离子交换：R—NR4+Cl-+X-=R—NR4+X-+Cl-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2020/1/26四、离子对色谱ionpairchromatography原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。2020/1/26五、离子色谱ionchromatography离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一项技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。2020/1/261、离子色谱法原理离子交换原理，与传统离子交换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。2020/1/262、离子色谱优点（1）分析速度快可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2020/1/263、离子色谱装置类型suppressedapparatusofIC抑制型：抑制柱型、连续抑制型分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05毫摩尔/克干树脂。非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。2020/1/26离子色谱连续抑制装置图2020/1/26离子色谱连续抑制原理图2020/1/264、离子色谱的应用applicationofIC阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm。2020/1/26六、排阻色谱色谱size-exclusionchromatography固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离2020/1/26第三章高效液相色谱分析法一、液相色谱固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色谱流动相mobilephaseofHPLC三、分离条件的选择§3-3§3-4液相色谱的固定相液相色谱的流动相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseandmobilephaseofHPLC2020/1/26一、液相色谱固定相stationaryphasesofLC1.液-液分配及离子对色谱法固定相（1）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2020/1/26（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：≡Si—Cd.硅氮键型：≡Si—N2020/1/26化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；2020/1/262.液-固吸附分离固定相种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；2020/1/263.离子交换色谱分离固定相结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换