搜索
无菌检查与微生物检查•无菌检查的起源：•1665年，欧洲勃兰登堡候国御医约翰·西吉斯蒙德·埃尔斯霍尔茨发表了《新灌药法及其方式方法》•1831年，西欧霍乱肆虐，微粒拯救在死亡线上挣扎的病人，舒格兰医生赖特大胆启用静脉输液疗法，他将大量煮沸过的食盐水静脉输注给霍乱病人使大部分病人得救。•赖特在实践中观察到了输液产生的“注射液”•随着显微镜的发明和微生物的发现，人们开始了输液无菌检查的研究。无菌检查法的发展历史国际无菌检查法的发展历史1925年直接接种法首先使用在英国1932年英国药典推荐使用直接接种法无菌测试。1936年美国药典滴十一章首先引用单个培养基的直接接种法。1950年美国药典第十六章推荐使用FTG和SB两种培养基分别培养需、厌气菌和真菌。1957年美国FDA和MILLIPORE公司介绍膜过滤法用于抗生素无菌测试。1963年英国药典63版收载薄膜过滤法无菌测试。1965年美国药典引用薄膜过滤法用于非抑菌性药品的无菌测试。1971年欧洲药典第二版公布参照薄膜过滤法无菌测试。1978年欧洲药典修订版发行公布推荐使用薄膜过滤法无菌测试。1988年美国FDA规定假如第一次无菌检查不符合规定的样品不再复试，这一批次的药品应报废。排除了药品无菌阳性后再测试的机会。1998年英国药典1998版规定无菌检查以一次检出为准，取消复试。2000年美国药典24版规定无菌测试以一次检出为准，取消复试。我国历版药典无菌检查法的发展历史1953年版实验环境仅要求为半无菌操作箱；用一种培养基的直接接种法，取样量2支/瓶。1963年版仅收载直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌。1977年版开始收载简单装置的薄膜过滤法限于抗生素样品。用二种培养基指明分别培养细菌和霉菌。1985年版要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室；薄膜过滤法限于抗生素样品；开始收载需、厌气菌培养基及霉菌培养基。1990年版与85年版相同，无发展。1995年版开始要求对培养基进行灵敏度检查。2000年版规定试验环境为100级洁净度。要求全过程防止微生物污染，检验量从2支/瓶增加为6～11支/瓶；50ml以上大容量液体也用薄膜过滤法检查。首次收载了全封闭无菌测试技术。2005年版收载隔离系统，强调洁净度的验证，培养基适用性检查和灵敏度检查；增加稀释液、冲洗液的品种；开始明确规定检验方法的验证要求；应优先采用薄膜过滤法；延长培养时间为至少14天、取消复试。无菌检查操作•1）按操作sop规定，供试品在移入缓冲间前应除去外包装、用适当消毒液擦拭或浸没消毒外表面、编号，培养基同样用消毒液擦拭外壁，然后连同其他灭菌用品（包括无菌衣、帽、口罩等）移入物流缓冲间，开启洁净室（区）紫外灯和空气过滤装置进行灭菌1小时以上。•2）按操作sop规定，实验人员用肥皂、水清洗双手，关闭紫外灯，换灭菌鞋进入人流第一缓冲间，用消毒溶液消毒双手后戴无菌衣帽、口罩及无菌手套。再消毒双手或换第二付手套后经传递窗将实验物品移入洁净操作间。•3）将供试品和实验用物品按实验流程安置在超净台上注意不干扰洁净空气层流、及方便取用。•4）布置好日常检验同时的无菌室和工作台面动态的沉降菌、浮游菌监控测定。•5）用75%乙醇消毒双手和工作台面。•6）用接触碟法采集、监控实验开始前物品表面、人员无菌衣、操作双手手套的表面菌。•7）供试品处理和接种培养基：点燃酒精灯，用无菌75%乙醇棉球擦拭供试品外表面，用灭菌工具开启供试品容器或包装，过火焰数次，在选定的方法接种培养基或进行混合、稀释等步骤后接种培养基。•8）薄膜过滤法要求及操作步骤•应优先采用全封闭式薄膜过滤器。应选择低吸附的滤器及滤膜。滤膜孔径应不大于0.45μm。直径约为50mm。使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。•水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。薄膜过滤法一般步骤取规定检验量（或经稀释等处理）直接过滤（三联筒）用冲洗液冲洗（每张膜每次100ml，总量不得超过1000ml）其中2筒分别加入适宜的培养基，1筒作阳性对照另取2联筒作阴性对照按规定条件培养14天加入适宜的阳性对照菌按规定条件培养48-72小时阴性对照-、供试品-阳性菌生长良好+结果判断：符合规定9）直接接种法要求及操作直接接种法即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。直接接种法一般步骤取规定的供试品检验量（支或瓶）分别取规定检验量加至适宜的培养基中另取1管作阴性对照按规定条件培养14天加入适宜的阳性对照菌按规定条件培养48-72小时阴性对照-、供试品--阳性菌生长良好+结果判断：符合规定-10）对照试验•阴性对照试验：取无菌检查所用到的溶剂、稀释剂和冲洗剂同法操作（除无供试品外）作为阴性对照。——以证明所用物品的无菌性。•阳性对照试验：供试品阳性对照试验的用量同供试品无菌检查中每份培养基接种的样品量，加菌量为小于100个。阳性对照试验用菌选择原则①金黄色葡萄球菌②大肠埃希菌无抑菌作用及抗革兰氏抗革兰阴性菌为主的阳性菌为主的供试品供试品③生孢梭菌④白色念珠菌抗厌氧菌的供试品抗真菌的供试品选择验证试验中最敏感的菌株作为阳性对照试验用菌11）培养和观察•硫乙醇酸盐流体培养基置30℃～35℃培养。•改良马丁培养基置23℃～28℃培养。•培养14天。应逐日观察并记录是否有菌生长。•如在加入供试品后、或在培养过程中，发现浑浊，在培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种后的新鲜培养基是否再出现浑浊。•如出现浑浊，取培养液涂片染色，镜检，判断是否有菌。（3）结果判断及确证•阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。•若供试品均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；•若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。•开展同源性检查和分析以确证结果！开展同源性检查和分析的方法1、疑似阳性培养物的微生物学检测将复接种后再次出现的疑似阳性培养物，划线接种至大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或其他微生物鉴定用培养基表面，置相应温度培养18～24小时或直至培养基表面有菌落形成。观察并记录其菌落形态，挑取单个纯菌落进行革兰氏染色和镜检，观察并记录其染色特性及微生物形态学特征。并作生化实验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定该菌种。对已通过确认鉴定后的微生物应予以保藏，保藏方法参考甘油冷冻管保藏法。开展同源性检查和分析的方法2、疑似阳性物的溯源性检测将疑似阳性培养物的菌落形态、革兰氏染色结果、镜检结果、生化试验结果及菌种鉴定结果与洁净室（区）采集的浮游菌、沉降菌、表面接触菌及手套菌的相应结果结果对比(或用其他分析手段，如微生物红外分析系统或分子生物学技术）分析浑浊物与洁净区采集微生物的同源性，若浑浊物的以上结果与洁净室（区）内采集的微生物结果高度一致，则判为同源，表明该疑似阳性培养物来自洁净操作区或由于实验人员操作不当导致的污染，则该试验结果应判为无效。作重试处理。若比对结果显示同源性较低，则需进一步回顾无菌实验过程及作产品企业生产过程及环境菌的调查溯源。（4）结果无效和重试规定¤重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。结果无效（1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。结果无效（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。结果无效（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。（5）无菌检查法不复试的规定由来•1991年10月11日，FDA颁布了一项关于经无菌加工工艺和最终灭菌工艺生产药品的提案，并列出一份经无菌加工工艺生产的受污染或潜在污染而被撤回的药品清单。许多经对撤回药品的调查或检查发现，多数被撤回的药品均为无菌检查初检不符合规定者。•微生物污染的不均匀性•无菌检查法的局限性验证试验（1）验证目的确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或抑菌活性以已被充分消除。保证检验结果的准确、可靠及检验方法的科学与完整性。（2）无菌检查验证试验的思路和步骤某种样品采用某种方法检验得到准确可信证明供试品证明采用有效地方法是否有抑菌活性消除抑菌活性记录实验过程，形成验证报告、形成标注操作规范（SOP）（3）无菌检查法验证试验验证试验用菌种及菌液制备方法——除用大肠埃希菌取代铜绿假单孢菌外，其余菌株及菌液制备同培养基的灵敏度试验中规定。直接接种法验证试验方法薄膜过滤法验证试验方法验证试验注意点开展验证试验程序采用直接法的原来及验证重点原理：将规定量的供试品接种培养基使可能存在的污染菌生长繁殖到肉眼能观察到的程度。重点：1判断供试品有无抑菌性。（各试验菌能否生长？）2通过梯度培养基的用量，选择出能有效稀释供试品的抑菌性，使加入的各种试验菌（特别是敏感菌）得以生长的事宜的培养基用量。直接接种法验证试验操作流程目的：1验证供试品有无抑菌性2确定能消除抑菌性的培养基用量取硫乙醇酸盐流体培养基共8支（装量符合该品种培养基用量要求）取接种菌液→接种量→接种管数→培养天数＜100cfu/ml1ml（支）（天）金黄色葡萄球菌12（其中1管接入规定量的供试品）3～5大肠埃希菌1同上3～5枯草芽孢杆菌1同上3～5生孢梭菌1同上3～5取改良马丁培养基共4支（装量符合该品种培养基用量要求）白色念珠菌12（其中1管接入规定量的供试品）3～5黑曲霉菌1同上3～5直接接种法验证试验操作步骤图示（1）取硫乙醇酸盐流体培养基8管（装量符合该品种培养基用量要求）每2管为一组，（2）分别加入金葡、大肠、枯草、生孢的＜100cfu菌液，得4组含菌培养基。（3）取每组中的1管加入供试品规定量，另一管为阳性对照管。供试品供试品供试品供试品金葡大肠枯草生孢（4）取改良马丁培养基4管，装量符合该品种培养基用量要求，每2管为一组，分别加入白念、黑曲的＜100cfu菌液，取每组中的1管加入供试品规定量，另一管为阳性对照。供试品供试品白念黑曲直接接种法验证试验结果判断如含供试品各管中加入的微生物均为生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用。可以按此方法进行供试品的直接接种法无菌检查。如发现含供试品的任一管中微生物生长微弱、缓慢或不生长——说明供试品有抑菌作用。应考虑采用进一步扩大培养基的用量，或改用薄膜过滤法、或其它适宜的方法消除抑菌活性。并应重新进行验证试验直到验证所采用的方法充分消除其抑菌作用。采用薄膜过滤方法的原理及验证重点原理：供试品溶液经过微孔滤膜过滤后，将样品中可能污染的微生物阻留在滤膜上，用适宜的冲洗液冲洗掉抑菌成分后接入适当的培养基阻留在滤膜上的微生物得以生长繁殖到肉眼能看到的状态。验证的重点：判断供试品有无抑菌性。（各试验菌能否生长？）选择适宜的冲洗液、通过梯度冲洗液用量（每张滤膜冲洗液量上不超过1000ml）选择并确定能有效除供试品抑菌活性，使加入的各试验菌（特别是最敏感菌）得以生长的适宜冲洗溶液和冲洗溶液的用量。薄膜过滤法验证试验操作目的验证供试品是否有抑菌性；验证消除抑菌性的冲洗方法（1）将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，每张滤膜冲洗量为100ml×N次。（2）在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，各试验菌同法操作。（3）同时各取100ml相应培养基接入各试验菌作阳性对照试验菌100cfu→每种菌滤膜或滤筒数→加入培养基金黄色葡萄球菌1滤筒硫乙