柠檬酸发酵机制

BY白云仙吴雪琴廖文翡邵文博杨亚蓝吕佩纪星浩柠檬酸的发酵机制CONTENTS•概述•柠檬酸的生物合成途径•柠檬酸生物合成的代谢调节•柠檬酸的积累机制归纳一、概述•柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。性质：分子式C6H8O7，分子量192.12有两种形式水合物：100℃时融解，密度1.542g/cm3(18℃)无水物：无色晶体或粉末，熔点153℃有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚•天然柠檬酸存在于柑桔、柠檬、菠萝、无花果等果实内。•制造柠檬酸的方法有三种•（1）合成法•（2）自果实中提取•（3）发酵法•由于合成法成本高,而从果实中提取又受季节性和地区性的限制,所以各国多采用发酵法制造柠檬酸。来源黑曲霉简介•黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。生产历史•1784年瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提取出柠檬酸，并制成结晶。•1913年Zahorski首先利用黑曲霉生产柠檬酸。•1919比利时一家工厂成功的利用浅盘发酵法实现了柠檬酸的工业化生产。•1952年美国Miles实验室公司采用深层发酵法大规模生产柠檬酸获得成功，促进了柠檬酸工业的发展，2005年世界柠檬酸产量达到140万t左右。国内生产历史•1968年我国在黑龙江省和平糖厂建立第一个生产车间，以甜菜糖蜜为原料浅盘发酵生产柠檬酸，年产量100t。•1969年上海酵母厂在50m3罐上实验成功，利用淀粉为原料进行深层发酵生产柠檬酸。•上世纪90年代，我国只有5家50kt/年以上柠檬酸生产能力厂家，年生产力不足40万t，目前全国柠檬酸生产能力已达60万t以上，大小厂家500多个，已成为世界上最大柠檬酸生产国和出口国。•2005年，柠檬酸产量产品63万t，占世界总产量的44%。用途柠檬酸塑料铸造陶瓷食品医药化工饲料电子纺织石油皮革建筑摄影酸味剂增溶剂抗氧化剂除腥脱臭剂风味增进剂脱凝剂调色剂二、柠檬酸的生物合成途径葡萄糖丙酮酸柠檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EMP途径氧化脱羧羧化黑曲霉发酵用于生产柠檬酸•1953年，Jagnnathan等证实了黑曲霉中存在EMP途径的所有酶；•1954年，Shu提出葡萄糖分解代谢中约80％走EMP途径；•1958年，MeDomough等发现黑曲霉还存在HMP途径的酶，但HMP途径主要存在于孢子形成阶段；•1954－1955年，Ramakrishman和Martin研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA苹果酸草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸琥珀酸延胡索酸CO2Fe2+CO2CO2琥珀酰CoA•黑曲霉中存在两个CO2固定系统（需Mg2＋、K＋）：•1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强）•2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途径2ADP2ATP2H29ADP9ATP2×C3H4O3丙酮酸脱羧CO2固定C4C2缩合H2O3/2O23H2OC6H8O7柠檬酸•（一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节•1、正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。•铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。三、柠檬酸生物合成的代谢调节淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸CO2CO2CO2NH4+PiK+AMPATP•2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。•锰缺乏时，细胞内NH4＋浓度高，Aa浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过NH4＋升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。•3.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。（二）TCA循环的调节•1、TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。•顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。•2.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断），它被葡萄糖和NH4＋抑止。（是TCA循环中唯一不可逆的反应步骤）•3.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。•氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重新氧化时所需•标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。磷酸烯醇式丙糖酸丙酮酸乙酰CoA苹果酸草酰乙酸柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富马酸CO2Fe2+CO2CO2抑制α-酮戊二酸脱氢酶系TCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：•（1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键•（2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力•（3）TCA循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。四、柠檬酸的积累机制归纳：抑制蛋白合成NH4+解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径的畅通有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链②由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。①Mn2+缺乏③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。⑤随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。小组分工•资料查找：杨亚蓝纪星浩•PPT制作：白云仙廖文翡•纠错及校对：邵文博吕佩•PPT讲解：吴雪琴THANKYOU!