流式细胞仪分选仪工作原理

流式细胞分选仪工作原理陈邦添[e-mail]内容•流式的概念•流式的分析原理•流式数据解读•影响流式检测的因素•流式分选工作原理流式的概念流式细胞仪概念图•流式细胞仪通过检测器接收激光照射液流内细胞(或颗粒)产生的光信号，经过光电转换和统计分析，从而反映细胞物理化学特征和细胞功能。流式的检测对象细胞微藻细菌染色体单个的生物颗粒、可溶性细胞因子等流式细胞仪的检测内容细胞结构细胞大小细胞内粒度度DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性细胞受体流式分析原理流式细胞仪构造液流系统•承载细胞快速流动•形成单细胞流流体动力聚焦光学系统•激光：信号激发•滤光片：光信号传递•检测器：信号接收光信号检测•自发荧光•转染•荧光标记荧光信号•前向散射光(FS)•侧向散射光(SS)散射光信号散射光信号由细胞（颗粒）本身及其内容物对激光的折射产生，主要反映了细胞（颗粒）的物理特征如大小或内部复杂程度。散射光信号散射光信号前向散射光(FS)侧向散射光(SS)反映细胞大小反映细胞内部复杂程度FSSensorLaser前向散射光前向散射光（FS）信号的反映细胞的大小SSSensorLaser侧向散射光侧向散射光（SS）信号的反映细胞的颗粒度GranulocytesMonocytesLymphocytesRBCs,Debris,DeadCells可以根据细胞的大小和颗粒度这两个基本特征，对细胞进行初步的分群和分类。FS/SS散点图荧光信号Fluorescencedetector(FL1,FL2,FL3,FL4,FL5……)Laser细胞受体/分子核酸(DNA/RNA)蛋白酶染色体基因表达离子浓度细胞自身萤光或使用荧光染料、荧光抗体标记，对细胞的生物/化学指标进行检测荧光染料EXEM应用荧光染料EXEM应用•激光器和荧光检测器的数目越多，选择越广•激光功率越大，激发效果越好。荧光素选择电子系统•光电转换•数据处理•光电转换Area/Lin面积High/Peak峰高Width峰宽Log(对数)Lin(线性)流式分析流程荧光素/抗体细胞流式数据解读流式图的解读单参数-直方图：X轴表示荧光强度Y轴表示频数双参数-散点图：X轴与Y轴均表示荧光强度一个点表示一个细胞流式的结果图例百分比——目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例绝对数——目标细胞的浓度荧光强度——单个目标细胞上表达某种荧光素的多少细胞相对大小……（单参数）直方图（双参数）散点图影响流式检测的因素样本制备•单细胞悬液的制备：物理法、酶解法•标本完整性（有无严重溶血或凝血）•抗凝剂选择：EDTA（12-24h）、肝素(48-72h)•样本洗涤(washorno-wash)•样本浓度•细胞活率•染色步骤（胞外→胞内）影响流式结果的参数设置–阈值/触发信号（Threshold/Triger）–电压（Voltage）/增益（Gain）–荧光干扰（补偿Compensate）–圈门&设门（Gate）–统计（Statistics）•阈值/触发信号（Threshold/Triger）–数据采集的前提条件所选择的信号被称为阈值或触发信号–阈值可以量化，大于该阈值的细胞信号才会被收集，以排除不必要杂质的干扰•电压&增益–目的：调节检测器的信号扩增程度，信号随着电压或增益的增加而增强。–作用：通过电压及增益的调节区分信号强弱不同的细胞。–电压&增益增加，信号变强；反之，信号变弱。※电压调节阴性对照（同型对照，空白对照）：以阴性群完全出现，以正态分布为标准，调节电压使阴性对照的本底荧光处于比较低的水平。•荧光干扰（补偿Compensate）–当细胞携带两种或两种以上的荧光素时，受到激光激发会发射出两种或以上波长的荧光。–由于目前所使用的荧光染料发射谱较宽，虽然他们之间各自发射峰值各不相同，弹发射谱范围有一定的重叠，会对其他通道上的数值产生影响。SILENTUNTOUCHABLEUNTOUCHABLEUntouchable=其他染料没有干扰(cleanrow)Silent=不会漏进其他通道(cleancolumn)补偿矩阵※补偿调节单染管（表达单一荧光的样本）一定要使用阳性组，或阳性处理组，只有阴性群的样本无法调节电压。可以使用VeserComp一类的自动捕获抗体微球代替。•荧光补偿（Compensate）•FITC单染•荧光补偿（Compensate）•PE单染•圈门&设门（Gate）–圈门是在流式图中根据需要圈定一群细胞。–设门是将门内的细胞应用在其他图中进行进一步的分析。–门的种类很多，包括水平门、十字门、铰链门、多边形们、矩形门、椭圆型门等等。•圈门•设门（Gate）流式分选基于免疫荧光的单细胞分选喷嘴偏转板液滴充电++++---DropDelay废液口Laser细胞样本细胞LaserDelay收集管流式分选过程影响分选的因素•细胞状态（细胞浓度、粘附性）•样本处理（染色、对照）•仪器条件（液滴形成，DropDelay检测，断点维持）•分选操作（分选模式、阈值、设门）实验样品的准备•样品浓度:建议在1-10x106cells/ml•为避免样品聚集成团，上样前应用200目筛网过滤•粘附性强的细胞可考虑在培养液或PBS里加入BSA或EDTA•死细胞过多考虑应用PI/7-AAD等染料排除仪器设置：液滴形成液滴形成的要素：•喷嘴•振荡频率•压力喷嘴选择•不同的细胞大小和细胞特性，理应选择不同规格的喷嘴头，建议：•细胞应约为喷嘴直径的1/3～1/4CytoNozzleMoFloXDP：50(染色体，亚细胞结构),70,80,90,100,120,150,200μm（大型真菌、原生质体）；细胞种类浓度喷嘴Lymphocytes,thymocytesorsplenocytes(直径8-12μm)8-12×106/ml70μmCelllines,Largeadherentcellline(直径20μm)5-8×106/ml100μm细胞随机分布情况200000Hz50000ev/s每4个液滴含有1个细胞200000Hz100000ev/s每2个液滴含有1个细胞200000Hz200000ev/s每个液滴含有1个细胞液滴形成率与分选速度震荡频率3倍细胞流速是高分选效率的保证。频率和振幅的调节液滴规则，断点清晰，间隔明显DropDelay检测和维持•延迟时间：影响分选纯度•断点位置：因此液滴延迟液流稳定常见因素：•管路中有气泡•环境温度过高•压力泵故障/漏气解决方法：•提前换液/debubble•控制温度25oC•查看压力表、管路接口分选前应先观察断点液滴的位置，保证30min内其位置不发生改变分选模式富集模式所有带有阳性细胞的液滴都被分选纯化模式所有带有阴性细胞的液滴都放弃单细胞模式液滴里只有一个阳性细胞的被分选。PositivecellNegativecellDropletsCellsCompanyConfidential多群同时收集Questions