反向遗传学及其相关技术

第四章反向遗传学及其相关技术一、概述（一）遗传研究的二条途径1、表→里：正向遗传学研究杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在的基因及数目→基因的功能及作用性质。这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采用的研究方法。2、里→表：反向遗传学研究在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。（二）RNA病毒的反向遗传学采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆，一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在体内(invivo)有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。RNA病毒的反向遗传操作RT-PCR构建RNA病毒的全长cDNA，并进行遗传修饰↓与RNA聚合酶启动子结合体外转录病毒RNA↓转录物RNA感染哺乳动物细胞↓拯救到活病毒↓拯救病毒的表型变化↓病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等单正股RNA病毒：RNA聚合酶+mRNA–++–+中间型结构蛋白+子代正股RNA单负股RNA病毒：RNA聚合酶–+结构蛋白–子代负股RNA逆转录病毒：＋＋RNARNA/DNA中间体逆转录酶DNA/DNA宿主＋＋子代RNA正股RNA与负股RNA病毒、逆转录病毒?（三）真核生物的反向遗传学采用反向遗传学鉴定基因功能是真核生物功能基因组学的主要内容。研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除/基因打靶、基因陷阱、基因激活等手段。利用基因敲除或基因沉默而产生的功能变化研究基因功能是主要的反向遗传学技术。二、反向遗传学相关技术1、基因的同源重组2、基因的位点突变3、基因沉默基因敲除利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。1、基因的同源重组①完全敲除：通过同源重组直接将靶基因在细胞或者动物个体中的活性完全消除。②条件敲除：将某个基因的修饰限制于特定类型的细胞或个体发育特定的阶段。完全敲除→条件敲除→特定组织/时间基因敲除基因敲除1）通过同源重组的基因敲除步骤构建重组载体↓重组DNA转入受体细胞核内↓筛选目的细胞↓转基因生物重组载体的类型：a)替换性载体系统：包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道基因等成分。b)插入性载体系统：插入基因片段(目的基因)、同源序列片段、标志基因片段。用替换型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验2）Res同源重组系统——源于λ噬菌体Res重组酶的重组系统Ha和Hb:同源重组区域Pa和Pb:引物位点sm:筛选标记Red同源重组技术用于基因打靶3）Cre-LoxP同源重组系统——源自P1噬菌体的重组系统属于传统的同源重组载体，但具有时空调控的功能。该系统由P1噬菌体的Cre重组酶和LoxP位点两部分组成。Cre重组酶：由Cre基因编码，识别LoxP位点，介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。LoxP位点：由2个13bp的反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成。Cre酶Cre酶Cre酶Cre重组酶13bp的反向重复序列Cre-LoxP重组系统的特点CreCrea)Cre重组酶所催化的是一个可逆的重组事件b)Cre催化重组不需要任何辅助因子的参与①介导两个同向LoxP位点之间序列的插入/缺失（下左）②介导两个反向LoxP位点之间序列颠倒（下右）③介导两条含LoxP位点DNA链的交换或染色体易位。Cre-Loxpgeneknock-outsystem4)高等动物基因敲除技术►真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。►显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。►胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。模式动物小鼠中完全基因敲除的步聚近交系，白色，易产生免疫缺陷2、基因的位点突变1）点突变—TILLING技术TILLING(targetinginducedlocallesionsingenomes)—定向诱导基因组局部突变，是一种快速有效地从由化学诱变剂(EMS)诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。先用化学诱变剂(甲基磺酸乙酯，EMS)诱发产生一系列的点突变，再用设计的特异性引物进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物变性和退火形成异源双链核酸分子，再用特异切割错配的内切酶CELl酶切，最后变性处理后采用双色聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测分析。（建池）TILLING特点：TILLING技术属于高频率点突变和PCR筛选相结合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变类型。可获得大量的等位基因系列，对长度很小基因，复等位基因等具有独特的技术优势。可诱导产生高频率的点突变，筛选目的基因需要较小的突变群体。不依赖于农杆菌介导转化或内源标签系统，无需耗时的转基因和复杂的组织培养。需要知道所研究基因的序列。2）随机插入突变A.T-DNA插入突变以农杆菌介导的转化为基础的一种插入突变研究方法，根据插入位点的基因序列与植物表型变异等的相互关系可以从基因组中分离出相应的基因并鉴定其功能。构建T-DNA载体→转化→突变体的筛选及遗传分析→分离T-DNA插入位点的侧翼序列→基因的定位、结构与功能分析。T-DNA法敲除植物基因及突变体筛选：a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段引物。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b.PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。T-DNA插入特点：不能控制其在生物体基因组中的插入位点。在植物中用T-DNA插入来敲除一个特定基因仍需要运气。隐性突变与显性突变：隐性——表型的变化只能在转化体的部分后代中体现出来（基因敲除）；显性——可以在转化体中直接观察到（基因激活）。某些特定基因，由于其特性在基因敲除后并不体现出功能的丧失。原因：重要的功能基因突变致死和冗余基因。染色体重排：突变体表型与T-DNA插入无关。效率不高，工作量大。建立饱和的突变体库。B.转座子插入突变利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。由转座子引起的突变可以转座子DNA为探针，从突变体的基因组DNA文库中筛选到突变的基因，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。也可以利用PCR的方法扩增转座子的侧翼序列，进而得到完整的基因信息。转座子插入特点：①插入的是完整的元件，便于分析。②可从插入位点切除，产生回复突变，因此不仅可以据此确认真正由转座子引起的突变，还可以进一步验证突变基因的功能。③转座子倾向于插入转座子的临近区域，可以用来研究基因组某一局部区域的结构。④通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化系就可以获得整个基因组的饱和突变，大大减少了工作量。⑤可以应用于转化效率不高的植物。转座子系统I.Ac/Ds系统由自主性元件（Ac）和非自主性元件（Ds）构成。Ds元件能够在Ac编码的转座酶的作用下移动，去除Ac元件可使其自身不能转座。通过遗传杂交引入自主性元件，转座子插入序列可以重新移动。因此，Ac/Ds转座子插入系统只需要少量的转基因品系（启动品系）作为转座源即可。在真核系统中，转座插入事件常不能产生可见的表型，这是因为功能基因的冗余或在早期产生致死效应。采用经修饰的转座子可克服这些困难。修饰：转座因子后带一个报告基因，报告基因的表达只有在转座事件发生的情况下才能获得，这样就可以通过报告基因来检测转座子的表达情况。修饰的Ac/Ds转座子系统增强子陷阱(enhancertrap)：转座子含有一个具弱小启动子驱动的报告基因。报告基因的表达只有在转座发生在内源增强子附近时才能获得。启动子陷阱(promotertrap)：转座子带有一个无启动子的报告基因，这个基因只有在转座子插入一个植物活跃的内源启动子下游时才能表达。修饰的方法-增强子陷阱与启动子陷阱II.Mu转座子系统转座子打靶载体是以两种噬菌体Mu为基础的mini-Mu转座子，每个转座子上都携带标记基因。可以在拟删除基因两侧各插入一个mini-Mu转座子，然后在两个插入位点之间制造缺失。这种缺失可以使两个转座子加上靶区之间的部分基因转移。特点：不需要知道基因组序列，仅已知外显子即可载体构建迅速，技术简单载体可以携带多种不同抗性基因，可以同时处理多基因。三、基因沉默技术I.反义RNAII.RNA干扰（RNAi）I.反义RNA技术反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根据反义RNA的作用机制可将其分为三类：1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象的变化，从而抑制其翻译。3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶mRNA的转录。（一）概念RNA干扰(RNAinterference，RNAi)：与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种序列特异性转录后基因沉默现象。II.RNA干扰基因沉默转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)基因沉默转录水平的基因沉默（TGS）是指基因在细胞核内RNA合成受到了阻止而导致基因沉默。转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：1.基因及其启动子甲基化：通常发生在DNA的CG序列的碱基上，该区域碱基甲基化往往导致转录受抑制。2.同源基因间的反式失活：拥有同源序列的沉默位点和其他位点的DNA的相互作用而引起的基因沉默。甲基化并失活的基因能作为一种“沉默子”，对其他具有同源性的靶基因施加一种反式作用，使具有同源序列的靶基因发生甲基化并导致失活。反式失活的靶基因既可以与沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。3.后成修饰作用导致的基因沉默：指转基因的序列和碱基组成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。这种修饰作用所造成的转基因沉默是可以随着修饰作用的解除而被消除。后成修饰作用导致的转基因沉默与受体植物的核型构成有关。4.重复序列：外源基因如果以多拷贝形式整合到同一位点上，形成首尾相连的正向重复或头对头、尾对尾的反向重复，则不能表达，而且拷贝数越多，基因沉默现象越严重。这种重复序列诱导的基因沉默可能是重复序列间自发配对，甲基化酶特异性识别这种配对结构而使其甲基化，从而抑制其表达。转录后水平基因沉默（PTGS）则是指基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细胞质里却无相应的mRNA存在的现象。引起转录后水平的基因沉默机制主要有以下几种：1.共抑制：由Napoli在转CHS基因的矮牵牛花中发现，普遍存在于转基因植物中。其发生是由于外源基因编码区与受体细胞基因间存在同源性而导致外源基因与内源基因的表达同时受到抑制。具有同源性的外基因和内源基因在细胞核内的转