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胚胎干细胞在毒性评价研究中的应用军事医学科学院毒物药物研究所闫长会化学物的安全性问题令人担忧•目前十万多种化学品在欧盟使用。•从1993年以来，只有141种大用量化学品被定为首批进行安全评估的化学品。•欧盟理事会批准的《注册、评估、授权和限制化学品》法规已在2007年6月1日生效，并据此成立了欧洲化学品总署。计划用50-100亿欧元和10-15年时间对尚未注册的三万多种化学品进行安全评估。欧盟•目前全球登记在册的化学物质多达2600多万种,较为常用的约6-7万种,包括工业化学品、农药、环境污染物、食品添加剂、医用化学品、生物毒素及军用毒剂等。•随着工业生产的发展,人工合成化学物质的种类不断增加,每年至少还有1000多种新化学物质进入人类的生产与生活环境。•在一定条件下,许多外源性化学物质都能通过呼吸道、胃肠道或皮肤进入体内并损害机体,成为毒物。全球传统的安全性评价手段给予一定数量实验动物大剂量待测化学物，观察其毒性效应特征，然后将实验结果外推到暴露于小剂量相同化学物的大量人群。存在问题：种属外推剂量外推实验周期作用机制解决方案：灵敏度高特异性强周期短体外细胞模型的局限性•将动物实验资料外推到人一直是毒理学家面临的重要课题,而应用人细胞进行研究是减少种属差异造成的不确定因素的途径之一。•目前用于毒理学研究的人细胞体外模型都有不同程度的局限。例如:人原代细胞(如肝细胞等)难以获得,而且变异性大,在体外增殖有限;人永生化细胞系的生物学特性已经异化,与人体正常细胞差别很大,肿瘤细胞系已丧失了正常的增殖分化调控能力。•缺乏预测对人体有效性和毒性的评价方法,目前动物模型预测人体心脏、肝脏及发育毒性的有效率只有50%。•先导优化应用的体外细胞模型(如HEK293,CHO细胞)与人体药物作用靶标不一致。•能直接预测人体的体外模型将是减低研发成本,确保安全性的新希望。体外细胞模型的现状生长在小鼠成纤维细胞滋养层上的hES细胞克隆胚胎干细胞的基本概念(Embryonicstemcells,ES细胞)•胚胎干细胞是一种来源于早期胚胎(桑椹胚或囊胚)或早期胎儿原始生殖嵴的细胞，具有发育全能性(具有分化发育成三个胚层细胞的潜力),是动物多种组织细胞的祖细胞。ES细胞的基本特点1.高度的发育潜能和分化潜能(全能性或多能性)。2.可操作性。它具有体外培养细胞的特征,可以在体外培养扩增,还可以对其进行遗传操作,选择和冻存,而不失其多能性。3.无限扩增(自我更新)。它在不同的生长条件下具有不同的功能状态。ES细胞的形态学特征1.细胞体积小;2.核大,核质比高,多为常染色质;3.具一个或多个核仁,且大;4.胞质较少,结构简单;5.胞质内细胞器成分少,但游离核糖体丰富；6.超微结构显示未分化的外胚层细胞特性。ES细胞与其它细胞的区别主要区别肿瘤细胞或转化细胞原代细胞胚胎干细胞基因稳定性非整倍体整倍体整倍体生长异常不能增殖正常数量无限受限无限细胞可变性随培养时间变化高度依赖于供体一致基因靶向有限无有人类特征健康稳定无限增殖单一来源全能分化完整个体标准指数微生物--/++-/+--2+动物瘤化细胞--++--2+完整动物-++-++4+人瘤化细胞+-++--3+人体活检细胞+-----1+人胚胎干细胞+++++-5+ES细胞与其它评价载体的区别ES细胞实验研究的背景(一)自1981年Martin、Evans等成功地分离培养出未分化小鼠ES细胞以来，研究者利用ES细胞体外特性开展了多方面研究，根据ES细胞的特性而发展起来的胚胎干细胞实验（Embryonicstemcelltest，EST）可以从细胞毒性、分化抑制以及分子生物学水平反映发育毒性。ES细胞实验研究的背景(二)1995年欧洲替代方法认证中心(EuropeanCenterfortheValidationofAlternativeMethod，ECVAM)决定在德国ZEBET、意大利的IIVS、ECVAM三个实验室进行了EST实验批准前的研究。2000年7月ECVAM批准EST实验为体外药物和化合物毒性筛选的合法途径。EST的优势1.是发育毒理研究的理想模型，无须牺牲大量怀孕动物;2.不用担心对动物或人体的巨大副作用;3.为药物筛选、鉴定以及毒理研究提供可靠模型，提高药物筛选的可信性;4.可与计算机等分析方法结合，因而具有更高的准确率和敏感性;5.可以进行分子水平的定量研究;ES细胞是体外胚胎毒性筛检的良好模型ECVAM曾在360种受试物中挑选出具有明确体内胚胎发育毒性实验数据的30种，使用EST实验进行胚胎发育毒性检测，结果显示与体内结论的符合率达到82%，其中强胚胎毒性的符合率更达到100%。ES表型和毒性表现差异的研究利用不同外源基因转染ES细胞或者在ES细胞水平进行基因敲除、基因打靶等定向突变,建立转基因细胞和转基因动物、基因敲除动物或基因打靶动物,进行基因功能缺失、基因功能获得的研究。通过细胞和动物的表型和毒性表现差异的研究,可以进一步明确基因的功能、表达与调控。ES细胞在化合物的毒性机制的研究利用ES细胞可分化为包括生殖细胞在内的体内各种细胞和组织,对于探讨外源性化学物以及X射线等物理因素的毒作用机制和筛选靶组织有着重要的价值。人胚胎干细胞毒理学研究的意义●应用人干细胞进行毒理学研究将使毒理学家获得更直接的外源性化学物质对人体影响的毒理学资料,使危险度评价更符合科技发展和保护人类健康的需要,也能缩短实验周期,增加实验的敏感性,克服用终末细胞研究远离化学因素(药物)作用位点的不足。hES细胞在安全性评价中的应用(一)体外胚胎发育毒性的筛检•目前体外替代方法中使用的人源性细胞只有癌细胞系或原代培养细胞；•利用mES的EST很难将结果外推到人；•全能性使hES成为体外发育毒性的优秀评价模型。hES细胞在安全性评价中的应用(二)hES分化的肝细胞•目前使用的肝细胞株代谢酶含量极低，hES分化的肝细胞是进行化合物体外代谢的最佳细胞模型；•肝脏拥有多种细胞，很多在化合物代谢中的功能尚未阐明，hES有望成为模仿简单肝组织的模型用在药物评价中。hES细胞在安全性评价中的应用(三)hES分化的心肌细胞•hES分化的心肌细胞(hESCM)是药物安全性评价中使用的唯一人源性心肌细胞；•hESCM与自动平台的结合使得筛选QT间期延长的模型实现高通量模式。人胚胎干细胞的应用范围确定毒性靶器官；确定作用靶位及其机制;确定毒性作用生物标志物。先导筛选优化；早期毒性实验；快速动物模型筛选；发现临床前新安全标志物；作用机制；代谢类型；等等。可应用于药物研发的全过程及安全性评价谢谢！