第07章 荧光免疫技术

第七章荧光免疫技术基本原理用荧光素标记Ab或Ag，与待测标本中相应的Ag或Ab结合，通过检测荧光，确定标本中有无相应的Ab或Ag。Ab*（Ag*）+Ag（Ab）Ab*-Ag/（Ag*–Ab）荧光紫外线检测分类fluorescenceimmunoassay（定量）fluorescenceantibodytechnique，FAT（定位、定性）本章主要内容第1节概述第2节荧光抗体技术第3节荧光免疫分析技术第4节荧光免疫技术的应用第一节概述基态分子激发态分子吸收能量光能热能电能化学能释放能量其他形式光辐射荧光磷光光致发光荧光的基本知识1.荧光（fluorescence）：基态分子吸收一定波长的光后转为激发单重态，在迅速返回基态时发射出波长比激发光长的光。2.发射光谱:指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。3.激发光谱:指固定检测波长，用不同波长的激发光激发样品，记录相应的荧光发射强度。基态发射光（荧光）基态（荧光物质）激发态发射光谱激发光谱激发光4.荧光效率:荧光物质将光能转变成荧光的百分率,一定范围内与激发光强度呈正相关。荧光效率=应选择荧光效率高的荧光物；特定波长处有最大吸收峰或最大发射谱。发光强度）吸收光的光量子数（激荧光强度）发射荧光的光量子数（5.荧光寿命:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同,镧系元素的鳌合物具有较长的荧光寿命。铕铽铈Eu3+Tb3+Ce3+6.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退，称为荧光淬灭。紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。淬灭原因：激发态无法回到基态，因此无荧光。意义：荧光免疫检测中避免荧光淬灭的发生；消除非特异性荧光（本底）的干扰。7.荧光偏振FH－FLP＝──────FH＋FLFHFL检测激发激发P：荧光偏振度FH：起偏器和检偏器平行时的荧光强度FL：起偏器和检偏器垂直时的荧光强度荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定四乙基罗丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标记FAT藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定８.荧光标记技术的常用荧光物质（荧光素）9.检测仪器荧光显微镜荧光计共聚焦显微镜流式细胞仪器光源：高压汞灯、氙灯，很强激发光源。超高压汞灯启动后，在每次使用2h的情况下平均寿命约为200h；开动一次工作时间愈短，则寿命愈短，如开一次只工作20min，则寿命降低50%；灯熄灭后要等待冷却才能重新启动；点燃灯泡后不可立即关闭，一般需要等15min。荧光显微镜的基本结构光源：高压汞灯荧光显微镜的基本结构荧光显微镜的基本结构1.光源2.灯室反光镜3.集光透镜4.隔热滤光片5.视野光栏6.激发滤光片7.反光镜8.聚光镜9.标本10.物镜11.吸收滤光片12.目镜滤光片：隔热滤光片：可阻断红外线激发滤光片：紫外光滤片(275nm~400nm)蓝紫外光滤片(325nm~500nm)蓝绿光滤片(﹥500nm)吸收滤光片：410~650nmOG(橙黄色)GG(翠绿色)透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路(b)荧光显微镜的基本结构光路：荧光显微镜的基本结构聚光器：明视野聚光器：常用，聚光力强暗视野聚光器：分辨率高相差荧光聚光器：较少使用第二节荧光抗体技术一、概念荧光抗体技术：采用荧光素标记抗体与组织切片中的抗原反应，洗涤分离后，荧光显微镜下观察特异荧光，显示抗原抗体复合物的存在及其部位。可对组织细胞中的抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度的测定。二、抗体的标记与鉴定1.对抗体的要求：纯度高，单抗最好2.对荧光素的要求：易于标记、标记物性质稳定不影响抗体的亲和力和特异性荧光效率高、荧光颜色与背景颜色差别大安全无毒3.标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。4.标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。三、标本来源主要标本为组织切片、组织印片、细胞涂片、微生物涂片、脱落细胞涂片和体液浓缩标本涂片等。制片要求：检材新鲜保持抗原的完整性细胞层为１２层减少非特异荧光物质吸附1.直接法:荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。四、荧光抗体技术的类型和结果判定（一）技术类型2.间接法:特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的二抗再与第一抗体结合。3.双标记法:两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，与同一标本不同抗原表位反应。ThCD3CD4（FITC黄绿）（RB200橘红）（二）荧光抗体染色标本的结果判断在有效时间内观察每次实验设阴性对照和阳性对照按照荧光强弱不同，记录为：－±＋＋＋＋＋＋阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型（二）荧光抗体染色标本的结果判断均质型核膜型第三节荧光免疫分析荧光免疫分析的基本原理将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。均相荧光免疫测定（homogeneousfluorescenceimmunoassay）非均相荧光免疫测定（heterogeneousfluorescenceimmunoassay）荧光免疫分析技术类型荧光偏振免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定一、时间分辨荧光免疫测定检测原理①时间分辨②Stokes移位③发射光谱和激发光谱④荧光标记物的比活性⑤信号增强标记物和标记方法实验方法方法学评价自发荧光寿命短:1ns～10ns镧系元素寿命长:10μs～1000μs①时间分辨1.检测原理荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.0短寿命荧光完全衰变后再测定镧元素特异荧光时间分辨检测原理示意图①时间分辨1.检测原理Stokes移位：激发光谱和发射光谱的波长差。镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠。②Stokes移位发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高③发射光谱和激发光谱比活性：单位时间每个标记分子被探测的信号量。荧光激发光源1000次/s激发，比活性提高。④荧光标记物的比活性⑤信号增强镧系元素标记物激发较弱荧光弱碱性紫外激发光（百万倍）高强度荧光酸性增强剂pH2～3Eu3＋解离β－2二酮体（螯合剂）新Eu3＋螯合物“微胶囊”TritonX－100排斥水分子荧光寿命长：10～1000μs，时间差---时间分辨Stokes位移大：270nm，易分辨发射光谱带很窄：波长613±10nm，降低本底激发光谱带较宽：波长300～350nm，提高灵敏度镧系元素的荧光特征：比活性高:荧光激发光源1000次/S激发高强度荧光2.标记物和标记方法荧光物质荧光寿命(ns)荧光物质荧光寿命(ns)非特异荧光背景1～10Sm3+-β-NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-β-NTA714000细胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黄酰氯14Dy3+-PTA1000罗丹明B3.02.标记物和标记方法2.标记物和标记方法1－（对苯偶氮）－EDTA异硫氰酸苯基－EDTA异硫氰酸苯甲基－DTTA镧系元素必须通过螯合剂才能与蛋白质结合镧系离子－螯合剂－Ab（Ag）复合物常用双功能螯合剂：标记方法：一步法：Eu3+－螯合剂＋蛋白质二步法：（螯合剂＋蛋白质）＋Eu3+3.技术类型双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法（1）双抗体夹心法（测抗原）固相抗体和Eu3+标记抗体与待检抗原结合，形成固相抗体-待检抗原-Eu3+标记抗体复合物；酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。（2）固相抗体竞争法（测抗原）包被抗体于固相，待检抗原和Eu3+标记抗原与固相的抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测荧光强度，荧光强度与待检抗原量成反比。增强液激发固相AbAg？AgEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关（3）固相抗原竞争法（测抗原）包被抗原于固相，待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。增强液激发固相AgAg？AbEu3+荧光强度与待检抗原含量成负相关定量灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：4～5个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高方法学评价基本原理荧光酶免疫测定荧光物质产生示意图碱性磷酸酶标记抗体或抗原，固相载体包被抗原或抗体，酶分解4-MUP，脱磷酸根基团形成4-MU，360nm激发光照射，发出450nm荧光。二、荧光酶免疫测定常用酶和底物二、荧光酶免疫测定荧光酶免疫测定标记用酶及荧光底物标记酶底物荧光产物激发光(nm)荧光(nm)相应信号碱性磷酸酶4-MUP4-MU36045010β-半乳糖苷酶4-MUG4-MU36045010辣根过氧化物酶HPA二聚体3174140.03方法类型双抗体夹心法（测抗原）双抗原夹心法（测抗体）固相抗原竞争法（测抗原）二、荧光酶免疫测定双抗体夹心法固相抗体和酶标记抗体与待检原反应，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含量成正比。荧光酶免疫测定（双抗体夹心法）二、荧光酶免疫测定方法评价二、荧光酶免疫测定用酶和荧光底物的化学反应作为放大系统，提高灵敏度背景荧光干扰测定，用固相荧光酶免疫测定效果好光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。偏振荧光(绿光,525nm～550nm)偏振光(蓝光,485nm)溶液中的分子基本原理三、荧光偏振免疫测定样品激发垂直偏振光（458nm）蓝色偏振镜FPIA分析仪检测光源小分子物，旋转快，低荧光偏振AgAbAg大分子物，旋转慢，高荧光偏振偏振荧光（525~550nm）绿色发射抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比荧光偏振免疫测定原理示意图Ag-Ab（多）+AgF-Ab（少）AgF（多）小分子、旋转快激发大分子、旋转慢激发竞争Ab（定量）AgAgFAg少Ag-Ab（少）AgF-Ab（多）Ag多低偏振值高偏振值待检Ag浓度与偏振荧光强度呈负相关方法评价样品用量少荧光素标记试剂稳定，使用寿命长重复性好快速，易自动化适于小、中等分子物质检测灵敏度较非均相荧光免疫测定法低第四节荧光免疫技术的应用1.荧光抗体技术的应用2.荧光免疫测定的应用①自身抗体检测抗核抗体(均质型)抗核抗体(核膜型)抗核抗体(斑点型)1.荧光抗体技术的应用②病原体检测寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）细菌（藤黄微球菌)③免疫病理检测肿瘤（人肝癌细胞）④细胞表面抗原和受体检测⑤特殊应用：流式细胞术荧光免疫技术可用于