动力学亲和力分析

动力学/亲和力分析基础知识介绍BiacoreTraining2什么是动力学和亲和力?•动力学»反应发生的速度?–与时间相关»结合–分子间结合的速度»解离–分子复合物解离的速度»动力学分析能够确定在一个给定的时间跨度内，分子复合物是否能够结合还是完全解离•亲和力»分子间结合的强度?–与时间无关»亲和力分析能够确定反应处于平衡状态（结合与解离形成动态平衡）时，复合物的浓度BiacoreTraining3动力学分析和亲和力分析的相关性?•细胞本身就是一个动态系统–极少处在平衡状态•同样的亲和力，不同的反应，动力学数据一般并不相同»动力学数据提供了更多的信息BiacoreTraining4同样的亲和力，不同的动力学•所有4个化合物的亲和力数据相同KD=10nM=10-8M•结合动力学常数可有不同数量级范围内的改变，本例中为4个数量级konkoff(M-1s-1)(s-1)10610-210510-310410-410310-5时间浓度=1000nM30min60min所有靶位点被占据Response时间30min60min浓度=100nMBiacoreTraining5用Biacore获得动力学和亲和力数据的3种方式•监测结合和解离速率»亲和力动力学•监测稳态水平»亲和力动力学•监测溶液中游离的分析物分子»亲和力动力学BiacoreTraining61:1动力学模型的速率方程ABABABkakdABAssociation:Dissociation:Netrateequation:whereka-1[s]-1-1[Ms]kddissociationrateconstantassociationrateconstantkd[AB][AB]-ddtka[AB]ddt[A][B]kakd[AB][AB]ddt[A][B]M/sM-1s-1s-1MMMBiacoreTraining7平衡常数(Equilibriumconstants)Theequilibriumconstants:-1[M]theconstantequilibriumassociationthedissociationconstantequilibriumkakdkdka[AB][A][B][M][AB][A][B]Atequilibrium:AssociationDissociationkd[AB][A][B]kas-1Ms-1-1MMMKAKDBiacoreTraining8Biacore中的平衡和动力学•A是溶液中的待分析物(analyte)»A的游离浓度由流动系统控制，在检测中保持恒定•AB是结合复合物»AB的浓度可通过直接检测RU得到，表示为R•B是偶联在传感芯片上的分子»总浓度能用RU表示,相当于最大结合反应理论值Rmax»B的游离浓度即Rmax-RA+BABkakd我们无需知道复合物和配体的实际浓度！BiacoreTraining9Biacore中的速率和亲和力ABkakdABkakd[AB][AB]ddt[A][B]RU/sMRURUdRdtkakdmaxR][RRCABhasonebindingsiteandreactswithimmobilizedligandhasnidenticalandindependentbindingsitess-1Ms-1-1BiacoreTraining10传感图中的变量和表示方式BiacoreTraining11传感图中的信息•Rmax,Req和KD的关系BiacoreTraining12物质迁移（MassTransport）•在Biacore中，和动力学测量相关的一种现象»描述生物分子从溶液向芯片表面转移的过程»和生物分子间的相互作用无关•在Biacore中，所检测到的反应速率是物质迁移现象和分子间的相互结合作用的综合结果»通过使用合适的反应环境，质量转移导致的影响能够被最大程度地控制BiacoreTraining13什么是物质迁移?•扩散的物质迁移»单一样品在静态的系统中分析物梯度•经过一定的时间，靠近芯片表面的分析物的浓度将会逐渐降低，并逐渐在溶液中形成一个分析物浓度梯度BiacoreTraining14分析物的消耗和补充1.分析物由持续流动的样品所补充2.随着流速的下降，扩散效应会逐渐占据主导性、3.在配体/分析物表面发生的生物分子相互作用流动相高度扩散距离123BiacoreTraining15减少物质迁移的影响•更低的Rmax(ligand密度)•高进样流速»高流速有效减少了扩散距离•可选的预设分析模式中已考虑了物质迁移效应实验设计BiacoreTraining17实验设计稳态实验--分析亲和力•通过一系列不同的分析物浓度，确定达到稳态的结合水平•较高的偶联水平•浓度范围至少应该覆盖芯片表面的20-80%饱和度(RMAX)•设置对照芯片表面•设置至少一个浓度的样品重复•设置零浓度样品BiacoreTraining18必须考虑的几个因素动力学分析•试剂纯度•偶联方法•偶联水平•配体活性•样品流速•分析物浓度范围BiacoreTraining19分析物浓度动力学分析•浓度应该覆盖所有范围的结合曲线（低浓度—饱和浓度）•设置至少一个浓度的样品重复•设置零浓度样品BiacoreTraining20总结•亲和力分析»获得亲和力平衡常数»适合分析结合和解离速度较快的相互作用过程•动力学分析»获得反应速率常数和亲和力平衡常数»对分子间相互作用的详细描述»具有相同亲和力数据的反应，结合和解离速率常数往往完全不同»对于了解生物学反应过程来说，获得反应速率常数往往比亲和力分析更为重要ABAB