03+细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法进行初步观察形成可验证的假说设计对照试验收集资料解释结果作出合理结论查阅已有知识第三章细胞生物学研究方法第一节细胞形态结构的观察方法第二节细胞组分的分析方法第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术思考题第一节细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术（lightmicroscopy）二、电子显微镜技术(electronmicroscopy)第二节细胞组分的分析方法1、离心分离技术2、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法3、特异蛋白抗原的定位与定性4、细胞内特异核酸的定位与定性5、放射自显影技术6、定量细胞化学分析技术第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞的培养细胞工程一、光学显微镜技术（lightmicroscopy1、普通光学显微镜技术2.荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）3.相差显微镜（phase-contrastmicroscope）4.激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）5.微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）一、普通光学显微镜光镜样本制作（一）普通光学显微镜结构普通显微镜由聚光器、物镜和目镜三部分组成。尼康E-600显微镜LightPathwayofMicroscope分辨率（resolution）：能将物体相近两点分辨清楚的距离极限。D代表分辨力：D=0.61/NSin（/2）代表光波波长；N：物镜与标本间介质的折射率；（1或1.515）：镜口角（聚光焦点对物镜镜口的张角，140º）物镜镜口标本结论：通过公式可知光学显微镜最大分辨率0.2um减小分辨率需减小介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66显微镜的几个光学特点：1.介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好。2.sinα/2的最大值小于1；3.普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。因为它的分辨率有限，再放大也是空放大（1）固定(fixation)目的：使大分子交联而保持固定，避免实验中移位或丢失。试剂：甲醛、戊二醛机理：可与蛋白质的游离氨基形成共价键，将邻近蛋白分子交联。（2）脱水（3）包埋（embed）目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。试剂：蜡、树脂机理：可进入细胞内，起支持作用。（4）切片（section）目的：切成薄片，便于切片黏附在载玻片上进行染色。仪器：切片机切片厚度：1～10m（5）染色（staining）目的：使细胞成为可见。标本制作方法：A.选择性染色苏木精－细胞内核酸的分布伊红－细胞质染色B.特异性染色酶+底物抗原+抗体酶标记荧光标记二、荧光显微镜技术（FluorescenceMicroscopy）1、原理2、结构3、应用4、方法直接荧光标记技术（用荧光素直接标记）如用标记荧光素的肌动蛋白显微注射到培养细胞，可观察肌动蛋白分子组装成激动蛋白纤维。间接免疫荧光标记技术荧光蛋白基因与目标基因融合表达1.原理细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射也可发荧光。荧光显微镜对这类物质进行定性或定量研究。2、结构结构：在普通光学显微镜上添加一些附件：A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。B.滤片：根据性能分为两组。一组是激发滤片，作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；选择并让特异的荧光（染料发出的荧光）透过，表现出专一的荧光色彩。3、应用对特异蛋白质等生物大分子进行定性定位研究。主要用于细胞结构和化学成分等的研究。荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一抗体的抗体)偶联，再与第一抗体作用。绿色荧光蛋白对轮状病毒外壳蛋白的定位三、相差显微镜相差显微镜由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。1、原理：将透过标本的可见光的光程差（也就是相位差）变成光强差（即振幅差），从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。可用于观察活细胞。2、构造3、应用：不用染色，主要用于观察活细胞或活组织以及细胞核、线粒体等细胞器的动态，是体外细胞和组织培养工作的重要工具。2、构造聚光器或光源上安装环状光阑（annulardiaphragm)：使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。光线透过标本发生衍射，偏离了未透过标本的光线线路，波长延迟1/4。在物镜后加了相差板(annularphaseplate)，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，进一步增加了两组光线间的光程差（相板上有一环形区制成凹槽或凸起，器深度可使通过此区的光线提前或延迟1/4）（1）光的干涉现象（2）光的衍射：光波遇到障碍物时，传播方向发生偏离。如小孔成像。1952年，Normaski在相差显微镜原理的基础上发明。1.原理以平面偏振光为光源，光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜将这两束光会合，偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。2.应用：适于研究活细胞中较大的细胞器。微分干涉显微镜DIC显微镜下的硅藻分离的有丝分裂纺锤体左、微分干涉显微镜；中、相差显微镜；右、偏振光显微镜。激光共焦扫描显微镜技术（LaserConfocalMicroscopy）原理应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构。激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点；从焦点发射的光线经透镜汇聚成像，可通过共焦小孔被检测器检出；通过样品其他部位(非同一焦平面)激光发出的光线不能通过共焦小孔聚集成像，因此检测器不能检出。二、电子显微镜技术1、电子显微镜的基本知识电子显微镜以电子束代替了可见光，大大提高了显微镜的分辨率，可以观察细胞的亚显微结构。♣电镜与光镜的比较♣电子显微镜的基本构造2、主要电镜制样技术♣负染色技术♣冰冻蚀刻技术♣超薄切片技术♣电镜三维重构技术3、扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）电镜与光镜的比较电子显微镜与光学显微镜的基本区别分辨本领光源透镜电镜镜筒成像原理人眼0.2mm可见光光学显微镜200nm可见光(波长400～700nm)利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化100nm紫外光（波长约200nm）玻璃透镜不要求真空电子显微镜接近0.1nm电子束(波长0.01～0.9nm)电磁透镜1.33×10-3～1.33×10-5Pa利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电子显微镜的基本构造电镜的基本构造主要如下：A：电子束照明系统；B：电磁透镜成像系统；C：真空系统；D：记录系统；主要电镜制样技术超薄切片技术用于电镜观察的样本制备示意图负染色技术（Negativestaining）染色背景，衬托出样品的精细结构冰冻蚀刻技术（Freezeetching）（技术示意图）冰冻断裂与蚀刻复型：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）——主要研究生物大分子空间结构及其关系的主要实验手段。扫描电镜原理与应用：电子束被磁透镜汇集成极细的电子探针，电子“探针”扫描样品，激发样品表面放出二次电子，二次电子产生的多少与样品表面的形貌有关，探测器收集二次电子成象。二次电子产生的多少，反映在图像上为相应部位亮暗的差异。CO2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题一、离心分离技术用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。密度梯度离心：用于精细组分或生物大分子的分离。将要分离的细胞组分小心地铺放在密度逐渐增加的、高溶解性的惰性物质溶液表面，通过离心力的作用使样品中不同的组分以不同的沉降率沉降，从而形成不同的沉降带。各组分的沉降率与它们的形状和大小有关。二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。例：DNA的Feulgen反应显示法1924年，Feulgen和Rossenbeck发明。原理：盐酸水解，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，出现醛基，试剂中的无色品红与醛基反应，呈现紫红色。例：PAS（高碘酸-席夫反应）──鉴定多糖类物质高碘酸氧化多糖，游离出的醛基与Schiff试剂反应，生成红色化合物。DNA经稀盐酸（1mol/LHCl、60℃下水解）水解后，DNA分子中嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键被打开，嘌呤碱基被解离，在脱氧核糖的一端（脱氧核糖C-1位置）形成了醛基三、特异蛋白抗原的定位与定性1、免疫荧光技术：是根据免疫学原理，利用抗体同特异抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特异的抗原分泌的免疫球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。（图）★步骤荧光抗体制备标本处理：组织切片、冷冻切片、整装细胞等免疫染色：抗原-抗体反应观察记录★免疫反应直接法：Ag+Ab*镜检（*代表标记物）间接法：Ag+Ab1+Ab2*镜检★标记物可以为多种：荧光素─免疫荧光技术或称荧光抗体法酶─酶标抗体法（如辣根过氧化物酶）四、细胞内特异核酸的定位与定性光镜水平的原位杂交技术（同位素标记或荧光素标记的探针）电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）PCR技术五、放射自显影技术原理及应用：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。步骤：同位素标记的生物大分子前体物掺入细胞。放射自显影显示细胞内同位素所在位置。六．定量细胞化学分析技术细胞显微分光光度术（microspectrophotometry）细胞中有些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线，如核酸的吸收波长260nm，蛋白质280nm。利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。流式细胞仪（FlowCytometry）主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。一、细胞的培养动物细胞培养类型：原代培养细胞（primaryculturecell）与继代培养细胞（sub-culturecell）细胞悬浮培养→细胞贴壁→形成单层细胞→传代10代，出现衰竭→传代40-50次（这种传代细胞常被称为细胞系，cellline）又出现危机（有限细胞系）→出现变异，无限传代（永生细胞系）细胞株（cellstrain）具有特殊遗传标记或性质的细胞系。植物细胞原生质体培养（体细胞培养）单倍体细胞培养（花药培养）非细胞体系（cell-freesystem）二、细胞工程细胞融合（cellfusion）与细胞杂交（cellhybridization）技术单克隆抗体（mon