miR-155调控HGAL的表达和增加淋巴瘤细胞的运动

miR-155调控HGAL的表达和增加淋巴瘤细胞的运动汇报人摘要、前言方法、结果文本摘要•HGAL是弥漫性大B淋巴瘤和霍金斯淋巴瘤的病人的预后指标靶向结合miR-155•RhoA•actinHGAL•肿瘤转移细胞运动前言•HGAL:淋巴生发中心特殊基因，至少通过2个分子机制参与了淋巴细胞和淋巴瘤细胞运动的负调控。一是直接结合到肌动蛋白和肌球蛋白上，二是激活RhoA信号通路。但它本身的调控机制还不清楚。•miRNA：小的非编码RNA，在转录后调控基因表达参与调控多种的生命活动。他们参与免疫系统的调控可能对淋巴细胞引起的恶性肿瘤的发病有作用。方法•寻找miRNA靶基因和结合位点•RNA分离和miRNA定量PCR(real-timePCR)•DNA构建•荧光素酶报告实验•趋化实验•RhoApull-downassay结果miRNA155抑制HGAL的表达：蛋白水平的检测(A)在Raji,MC116,和VAL细胞系中转染高表达hsa-miR-15548小时后用Westernblot检测HGAL蛋白表达水平，Actin水平作为内参。从图中可以看出3个细胞系转染了miR-155后，跟对照比相比，HGAL蛋白表达量都有降低。miRNA155抑制HGAL的表达：mRNA水平的检测B.Raji细胞系中转染高表达hsa-miR-155通过real-timePCR在转染24,48,和72小时后检测HGALmRNA水平。结果从图中可以看出，在转染hsa-miR-15572小时后HGALmRNA的降低水平大到最大miRNA155抑制HGAL的表达：mRNA水平的检测C.MC116细胞系中转染高表达hsa-miR-155通过real-timePCR在转染24,48,和72小时后检测HGALmRNA水平结果从图中可以看出，在转染hsa-miR-15548小时后HGALmRNA的降低水平大到最大MiR-155直接作用于HGALmRNA的3＇-UTR上D、HeLa细胞系中：野生型和3＇－UTR突变HGAL融合双荧光素酶报告基因。黑柱代表共转染hsa-mir-155与报告基因与3＇－UTR突变Ｍ１或Ｍ２，灰柱表表共转染hsa-mir-155随机突变载体与报告基因。从图中可以看出miR-155可能结合位点Ｍ１突变后荧光素活性没有恢复，Ｍ２突变后荧光素活性恢复８５％。结果说明了miR-155转录后调控HGAL的表达是通过与HGAL-3＇UTR上的M2结合位点。MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性结果说明了MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性．Ａ．我们探索了miR-155对Raji,VAL和MC116淋巴瘤细胞SDF-1和IL-6趋化运动的影响。和对照组相比，转染了hsa-miR-155显著减少了HGAL蛋白表达，加强了SDF-1-诱导的的淋巴瘤细胞趋化运动。MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性结果从图上的结果可以看出MiRNA155增加淋巴瘤细胞的运动性．Ｂ、Raji细胞接种到fibronectincoated6-wellplates板上，转染hsa-mir-155或nontargeted对照组48小时后实时图像一小时内每2分钟拍一次的运动途径。C、在每个处理组中50的细胞平均速度。miR-155对RhoA活性的影响结果A、Raji，Val，和sudhl6淋巴瘤细胞实验前无血清培养饥饿8小时，然后用LPA（1.5µ克/毫升）处理45秒。转染hsa-mir-155或nontargeting48小时后。细胞裂解用Westernblot检测TotalRhoA的表达，和rhoapull-down检测RhoA-GTP的水平和检测HGAL的表达。从图上可以看出在Raji,SUDHL6,和VAL淋巴瘤细胞中转染了hsa-miR-155没有对总RhoA蛋白表达水平产生影响。说明了RhoA蛋白不是miR-155的直接靶标miR-155对F-actin的聚合的作用结果B、Raji，Val，和sudhl6淋巴瘤细胞实验前无血清培养饥饿8小时，然后处理或不处理45秒LPA（1.5µ克/毫升）处理45秒。转染hsa-mir-155或nontargeting48小时后。固定后用Alexa-488鬼笔环肽后的染色后用流式细胞仪分析。通过增加RhoA活性，HGAL同样作用于RhoA的下游效应物，下调应力纤维的形成和激动蛋白的聚合miR-155对F-actin的聚合的作用结果图4。bic/miR-155-/-小鼠脾B细胞趋化性实验。bic/miR-155-/-或对照组小鼠脾B细胞用于SDF-1和IL-6的趋化实验。从图中可以看出，miR-155并没有增加小鼠脾B细胞的运动性，这与体外培养的人属淋巴瘤细胞的结果是相反了，说明了在鼠科中，miR-155及M17（HGAL人属）的作用机制还有待进步一步的研究。miR-155上调RTKN2的表达结果图5A在RajiVAL,和MC116细胞系中转染hsa-mir-15548小时后用Westernblot检测RTKN2和肌球蛋白轻链蛋白表达水平。Actin作为内参。从图中可以看出，转染了hsa-mir-155后，RTKN2的表达减少但肌球蛋白轻链蛋白的表达没有影响。说明了RTKN2是miR-155在RhoA信号通路中的靶位点。miR-155对RTKN2的调控是直接的结果在HeLa细胞中共转染与野生型或rtkn23＇-UTR突变融合双荧光素酶报告质粒与hsa–miR-155。黑柱代表共转染了hsa–miR-155；灰柱代表共转染与nontargeting对照。在假定的结合位点的突变命名为M1和M2的3＇-UTR和两个位点同时突变为M1+2。从图中可以看出共转染hsa-miR-155与荧光素质粒到HeLa细胞中，荧光素活性减少60%。对M1进行突变后，荧光素活性恢复75%,对M2突变后，活性增加了80%。对两个位点都进行突变，活性全部恢复。结果这些结果说明了miR-155通过作用于HGAL和RTKN2增加了淋巴瘤细胞的运动性讨论•免疫应答中miR-155有活跃的作用•。在GC淋巴细胞分化过程中B细胞受体或是NFkB可以上调miR-155和PRDM1的表达，导致HGAL蛋白表达的下降，增加了淋巴细胞运动和从GC部位的出来•miR-155也参与在淋巴系统恶性肿瘤的发病机制•MiR-155诱导HGAL和PTKN2的表达，下调RhoA的信号通路，从而增加淋巴瘤细胞的运动miR-155同时调控了HGAL和RTKN2,他们又同时参与了RhoA通路和细胞运动