第五章 酶工程制药

1第五章酶工程制药EnzymeEngineeringforPharmacon2一、酶工程简介（EnzymeEngineering）酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。1953年，Grubhoger和Schleith提出了酶固定化技术。1969年，日本人用固定化技术拆分了DL-氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。第一节概述3二、现代酶工程的主要内容：a、酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；b、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究，包括酶传感器、反应检测；c、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶的研究；d、酶的分子改造和化学修饰，结构与功能的研究；e、有机相中酶反应的研究；f、酶的抑制剂、激活剂的开发与应用研究；g、抗体酶、核酸酶的研究；h、模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成研究。41、酶的来源：酶的生产目前只宜直接从生物体中提取分离。早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近10年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是：A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从微生物中得到；B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提高酶的产量；C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌珠。第二节酶的来源和生产菌562、酶的生产菌（1）对菌种的要求：a、产酶量高，酶的性质符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌；b、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生毒素；c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。（2）生产菌的来源：a、菌种保藏机构和有关研究部门获得；b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。7筛选产酶菌的方法：采集菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。（3）目前常用的产酶微生物A、E.coli：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、β-半乳糖苷酶。B、枯草杆菌：主要用于生产α-淀粉酶、β-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。C、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等。D、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。E、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。8一、固定化酶的制备1、固定化酶（immobilizedenzyme）的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。2、固定化酶的特点（1）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。第三节酶和细胞的固定化9二、酶和细胞的固定化方法1、载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。10C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。2、交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。3、包埋法：（1）网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。11（2）、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。4、选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。三、酶和细胞的固定化载体（1）吸附载体：无机物和有机物（2）包埋载体：卡拉胶、海藻胶（3）共价结合载体：纤维素、SephadexA200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃。12载体应具备的条件：（1）固定化过程中不引起酶变性；（2）对酸碱有一定的耐受性；（3）有一定的机械强度；（4）有一定的亲水性和稳定性；（5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；（6）共价结合时有可活化基团；（7）有耐受酶和微生物细胞的能力：（8）廉价易得。四、固定化酶的制备技术（1）吸附法制备技术：将酶的水熔液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。13（2）包埋法制备技术：凝胶包埋：先将凝胶材料与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点以下的温度，然后加入要固定化的酶液，混合均匀，最后冷却凝固成型和破碎即成固定化酶。微囊化包埋：将酶定位于具有半透膜的微小囊内。半透膜厚约20nm，膜孔径40nm.其表面积与体积比很大，包埋酶量也多。（3）交联法制备技术：向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶分子内或酶分子间彼此连接成网格状结构而形成固定化酶。反应速度与酶的浓度、试剂的浓度、pH、离子强度、温度和反应时间有关。如：0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛在pH5.2~7.2，0°C，24h即完成反应。14五、固定化细胞的制备1、固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶同被称为固定化生物催化剂。细胞固定化技术是酶固定化技术的发展，因此固定化细胞也称第二代固定化酶。固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，比固定化酶应用普遍。2、固定化细胞的特点（1）无需进行酶的分离纯化；（2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高；（3）细胞内酶比固定化酶的稳定性高；（4）细胞内酶的辅因子可以自动再生；（5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应（6）抗污染能力强。153、固定化细胞的制备技术（1）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。缺点：吸附容量小结合强度低。（2）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。（3）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。（4）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。16六、固定化方法与载体的选择依据1、固定化方法的选择（1）固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。（2）固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。（3）固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设备和劳务投资等。172、载体的选择为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。18七、固定化酶的形状与性质1、固定化酶的形状（1）颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。（2）纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。19（3）膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。（4）管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶等酶管。202、固定化酶的性质（1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。（2）酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。21A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即具有工业应用价值。B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否则活力逐渐下降。若需长期保存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。D、对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所提高。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。22（3）酶学特性的变化A、底物专一性：对底物的专一性下降。B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。C、最适温度：一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。D、米氏常数(Km)：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。23一、概述药用酶在使用过程中往往存在酶的活力不高、稳定性较差、有抗原性等不足之处。因此必须对药用酶进行分子修饰，以提高酶的药用价值。1、概念：主要通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的理化性质、某些特性和功能的过程，称为酶分子修饰。2、目的（1）提高生物活性（包括对效应物生物性能的改变）；（2）培养在不良环境（非生理条件）中的稳定性；（3）针对异体反应，降低生物识别能力。第四节药用酶的分子修饰241、大分子结合修饰利用水溶性大分子（PEG、PVP-聚乙烯