RT-PCR原理及方法09-10-15背景基因的表达基因组DNA(genomicDNA)信使RNA(messengerRNA,mRNA)蛋白质产物不同细胞或组织表达不同的基因目的通过反转录(reversetranscription,RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)的方法,检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度。原理及方法mRNA(messengerRNA)cDNA(complementaryDNA)PCR产物RT(反转录)PCR(聚合酶链反应)原理及方法步骤1--提取总RNATRIzol法抽提总RNA1、细胞1×107或组织100mg,加1mlTRIzol(细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底,后转至EP管)颠倒混匀10下,室温5分钟。2、氯仿1/5体积(0.2ml),颠倒混匀10下,室温5分钟。3、4℃,离心12000g,15分钟。4、转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中,加等体积异丙醇(约400μl),混匀室温10分钟。5、4℃,离心12000g,10分钟。6、弃上清,加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1ml。7、4℃离心7500g,5分钟。8、弃上清,空气干燥5-10分钟(不能完全干燥),溶于DEPC水中至20μl(可在55-60℃水中,10分钟助溶)。9、紫外分光光度计测总RNA浓度。步骤2—反转录(RT)逆转录反应:1、试剂浓度体积终浓度RNA23μl(11.5μl)Oligo(dT)150.05μg/μl4μl(2μl)0.005μg/μl混匀,离心,70℃5min。2、立即冰水浴,稍离心试剂浓度体积终浓度M-MLVBuffer5×8μl(4μl)1×dNTP10mM2μl(1μl)0.5mMRNasin40U/μl1μl(0.5μl)20μM-MLV200U/μl2μl(1μl)200U总体积40μl(20μl)混匀,离心,42℃60-90min。3、95℃10min(破坏MLV),4℃保存。步骤3—聚合酶链反应(PCR)PCR反应:反应体系:总体积20μl(50μl)试剂浓度体积终浓度TaqBuffer10×2μl(5μl_)1×dNTP10mM0.2μl(0.5μl)200uM上游引物10pmol/μl0.3μl(1μl)10pmol下游引物10pmol/μl0.3μl(1μl)10pmolcDNA模板(1-10μl)Taq酶2.5U/μl0.3μl(1μl)2.5U/μlDEPC水20μl-4.3μl混匀反应条件:95℃5分预变性94℃30秒变性X℃40秒退火72℃30秒延伸72℃7分终末延伸28-36循环,4℃保温步骤4—琼脂糖凝胶电泳加1-10μlPCR产物与上样缓冲液(1-2.5μl)混匀,加样,电泳。所需材料及试剂一、实验器具与材料:1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头:1ml、200μl、20μl3、匀浆管:5ml4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖)1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇)7、量筒:50ml、250ml、500ml8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml9、试管架:5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水11、铝制饭盒:4个12、塑料小饭盒:1个13、大瓷缸:2个14、锡泊纸:一卷15、卷纸:2卷16、三角烧瓶:带盖,稍大所需材料及试剂二、实验器具的处理与准备1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再高压)3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高温干烤所需材料及试剂三、试剂配制:1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇:用无水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)3、异丙醇:放入棕色瓶中4、氯仿:放入棕色瓶中5、琼脂糖所需材料及试剂四、几种缓冲液的配制:1、电泳缓冲液:Tris54g硼酸27.5g0.5MEDTA20ml?pH8.0蒸溜水1000ml5×TBE(贮存液)再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液+450ml水--→500ml工作缓冲液2、上样缓冲液:0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液,4℃保存所需材料及试剂五、琼脂糖凝胶的配制:1、1.0%:1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭(GoldenView)5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后进行电泳。2、1.5%:同上,将琼脂糖的量改为1.5g(分辨率要求高时使用)所需材料及试剂六、需购置的Rt-PCR材料:Taq酶(含MgCl2Buffer)200udNTP:1支oligo(dT)18:1ODpromegaM-MLV:1支promega(Buffer)RNasin:1支--20℃DEPC5gTrizol100ml/1瓶Invitrogen--4℃Marker:10μg0.2μg/mlTIANGEN所需材料及试剂七、引物合成1、β-actin:正义:5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′反义:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′2、par-4:正义:5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′反义:5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′3、退火温度计算2(A+T)+4(G+C)正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)4、引物各合成5OD,每OD一瓶分装好5、引物稀释:加DEPC水量为(μl)=?nmol/OD×管上所标OD数×100是为10pmol/μl浓度的引物溶液所需材料及试剂八、PCR产物电泳先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酚兰上样缓冲液,反复吸打混匀后加入上样孔进行电泳,一般电压为80-100V,电泳20-30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。注意事项总RNA提取过程中防止降解(低温、口罩、手套、帽子、器皿等的处理)PCR引物的设计PCR反应条件的摸索谢谢!