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电泳技术及其应用1234电泳原理及其分类SDS-PAGE电泳技术等电泳聚焦电泳双向电泳技术1电泳原理及其分类原理：带电颗粒在作用下电场，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis,EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。电泳分类：1依据支持物的性状：纸质电泳、粉末电泳、凝胶电泳、缘线电泳2依据支持物的装置形式：平板电泳、垂直板电泳、柱状（管状）电泳3依据pH的连续性：连续pH电泳（无浓缩胶）、非连续pH电泳常用的电泳技术：聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双向电泳琼脂糖电泳（大分子核酸、病毒类物质）2丙烯酰胺凝胶电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。分子量与凝胶浓度的关系丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD）1512～431016～687.536～945.057～212SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。当蛋白质的分子量在15KD—200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。依据分子量的大小确定浓缩胶和分离胶的浓度及标准蛋白。加入分离胶溶液pH8.8封水或饱和正丁醇溶液制备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。倒出水或正丁醇，并用滤纸吸干分离胶pH8.8加入浓缩胶溶液pH6.8制备浓缩胶插入样品梳样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。加入电极缓冲液pH8.3浓缩胶pH6.8通电分离胶pH8.8加入样品开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。安装-制胶-进样-电泳过程-剥胶-染色-脱色处理-凝胶成像-软件处理3等电聚焦电泳原理：等电聚焦电泳(IEF)是利用两性电解质载体形成一个连续而稳定的线性pH梯度，将两性电解质加入盛有pH梯度缓冲液的电泳槽中，当其处在低于其本身等电点的环境中则带正电荷，向负极移动；若其处在高于其本身等电点的环境中，则带负电向正极移动。当泳动到其自身特有的等电点时，其净电荷为零，泳动速度下降到零，具有不同等电点的物质最后聚焦在各自等电点位置，形成一个个清晰的区带，分辨率极高。如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度，则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI值与所处位点的oH值的差别带上正电或负电。等电聚焦电泳图谱4双向电泳双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis）是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。蛋白双向电泳的分辨率和灵敏度很高,可分离1000-3000个蛋白质,最高可分辨11000个蛋白质,pI差别小于01003个pH单位也可以被分辨，用于蛋白质分离。双向电泳应用：蛋白质组分析、细胞差异性分析、疾病标志分析、治疗检测、药物开发、纯度检测、微量化纯化等。双向电泳图谱谢谢聆听