9_霍乱弧菌样品采集及前处理

霍乱弧菌样品采集及前处理2012.9.20长沙内容•样品采集的总体要求•样品种类•采样方法及其注意事项•样品前处理增加或改动内容•两种新的水样采集方法Moore法（小体积水样）及Spira法（大体积水样）•水样的前处理方法杂质少的水体、浑浊水体、海洋和河口水样•食品的前处理方法贝类、鱼类、牡蛎样品采集的总体要求•应由受过专门培训的人员来执行•按照生物安全防护的要求进行操作•样品的唯一性标识及其相关信息要完整•送检箱每次用后须经消毒处理样品种类•粪便•病人呕吐物•尸体肠内容物•粪便污染的衣物及相关物体表面如地面•水体•食品•水生动物•苍蝇采样方法一、粪便标本•一般采用自然留便，若采样时病人无便或婴幼儿则可采用肛拭法。尽可能在急性期、抗生素使用前采集新鲜粪便，样品采集后应尽快送检。•留便：取自然排出的新鲜粪便，成形便采集约5g标本；水样便或典型的米泔水样便采集约5ml。•肛拭法：先用无菌甘油水或生理盐水湿润棉签，多余的液体紧靠管壁挤出；再用棉拭或肛门采便管由肛门插入直肠内约3cm～5cm（幼儿约2cm～3cm）处，轻轻旋转360°，擦取直肠表面黏液后取出。避免采便量过少（注意棉签上应沾有粪便）。采样方法一、粪便标本•采肛拭子时应注意拭子大小是否适宜、光滑、结实且不易脱落。•肛拭子标本如不能在2h内送达实验室，应插入Cary-Blair运送培养基运送，注意培养基应埋住粪便拭子，手接触的部分在管口折断弃去。采样方法一、粪便标本•粪便标本如果运送时间不超过24h，还可将其放在碱性蛋白胨水中室温运送。•标本与碱性蛋白胨水的比例为8mL～10mL碱性蛋白胨水可加入1mL～3mL液体便或指甲大小的成形便。过多的粪便量会降低保存液的pH值。•如果没有合适采便器材以及没有运送培养基时，可用无菌吸水纸条浸于液体粪便中，然后将吸水纸条密封于塑料袋中，放入冷藏箱中运往实验室。采样方法二、呕吐物和洗胃水•患者如有呕吐，应尽量采集呕吐物。•用无菌压舌板或棉拭子挑取少量呕吐物作为检材，放入自封塑料袋中并封好袋口或置于灭菌带盖瓶中，然后盖紧瓶盖，立即置于冷藏箱中。•洗胃水置于灭菌容器内冷藏送检采样方法三、物体表面•用灭菌棉拭蘸以灭菌生理水或碱性蛋白胨水涂擦被粪便污染的衣物、床单、食物操作台、砧板、地面等相关物体或怀疑污染物体表面，放入到装有少量生理盐水的采样管中，立即冷藏；或直接置于碱性蛋白胨水管中，常温下运往实验室。采样方法四、水体标本•包括河口水、江河水、沟渠水、池塘水、湖水、井水、港湾海水、乡镇自来水厂源水、医院污水排放口、下水道排放口、海水产品养殖水、海水产品交易市场的出水口等。需要时也可采集水体的底泥作为检材。•水样标本的采集方法有多种，各实验室应根据现场流行病学调查需要及实验室自身检测条件，如有无过滤器等等，作相应的选择。水源标本的采集方法1.盐水瓶法：•以灭菌的500ml盐水瓶采取水样至少450ml，但不能让水样充满整个瓶子，应留有一定的空气。一般在可疑污染的河流、池塘岸边的30cm深度以内的表层水采取水样。连续采取多份水样时，注意防止水样间相互污染。采取的水样应立即放入冷藏箱中尽快送到实验室。不能在3小时内送检者，应在采水点即将水样加入培养基中，摇匀，室温下运送至实验室。水源标本的采集方法2.Moore纱布集菌法：•该方法尤其适用于河流等流动水水样的采集，但对于静止水无优势。城市生活污水的采集也可采用此法，该技术的敏感性似乎不取决于污染源与采样点的距离，应将采样装置放在各主要管道输入口处。Moore纱布集菌法•取120cm×15cm纱布块（图-1），沿纱布长度方向折叠几次，在中心系一钓鱼绳(长1m以上)，为防止绳子被固定在树枝或其它物体上时被磨断，可以在绳子的末端系上一段金属细丝（图-1）。用牛皮纸包好，高压蒸汽灭菌备用。采样时，将纱布放在采水点的水中，然后将金属丝固定于岸边的树枝或其他物体上，放置24～48小时后，将带着水(约55ml)的纱布放入灭菌瓶中，置于冷藏箱后送到实验室。水源标本的采集方法2.Moore纱布集菌法：•如果是采集医院污水排放口、下水道排放口、肉联厂加工的出厂水等水样时，应将纱布放在各个污水管道系统入口处，并仔细评估采样点周围可能抑制目标菌分离培养的各种因素。•对于有倾倒腐败垃圾的污水系统进行采样时，应将纱布放在倾倒口的上游，以免有毒废弃物的污染，影响后续的病原体分离。水样采集后不能在3小时内送检者，应在采水点即将带水纱布加至增菌液中，摇匀，室温下运送至实验室。带水纱布与增菌液的体积之比应为10%～20%。Spira纱布集菌法水源标本的采集方法3.Spira纱布集菌法：•用于过滤并采集大体积水样（约1.5升）。•取500克的塑料瓶，在其底部掏一个2cm的洞（图-2）。洞的大小很关键，如果太大，水样过滤时会将纱布从孔中拉出来；如果太小又会引起水样过滤太慢。将120cm×180cm大小的纱布一层一层叠起来，折成30cm宽，放入带孔的塑料瓶中。既要使纱布相对比较结实又要使其仍有可压缩性，要能过滤大约瓶子体积的三分之二的水，而且要使水经过纱布过滤后流出去而不是从纱布旁边直接流出去。用牛皮纸将纱布包好，高压蒸汽灭菌后备用。将水样从瓶子的顶部注入并使其从底部流出。无菌操作取出纱布，放入盛有100ml10×浓缩增菌液的三角烧瓶或广口瓶中，补加水样至1L，混匀，室温下尽快送往实验室。采样方法五、食品•针对不同的可疑食品，采集整体或部分标本，带至实验室。注意采集过程中不同食品不能交叉污染。采样方法六、水生动物•选取活海水产品或涂抹拭子，置于塑料袋内（拭子标本可按粪便拭子保存运输方法处置），尽快送往实验室。•如有成箱的海产品，则采取多个海产品的体表作为一个标本送检，这可能比只做一只海产品体内检查的阳性检出机会多。•注意采集过程中不同海产品间不能交叉污染。采样方法七、苍蝇•在每个采样点以10～15只苍蝇作为一份标本放入自封袋或试管中，密封，置于冷藏箱中送实验室。样品前处理1.水样标本的前处理•滤膜法：将杂质较少的被检水样１00ml，注入已灭菌的滤膜（0.45µm)滤器中抽滤后，将滤膜取下，置碱胨水增菌培养基中，35℃～37℃培养6～8小时后接种至TCBS或其它选择性平板•吸附沉淀法：取水样450ml，先加入10%无菌碳酸钠溶液2ml及10%硫酸亚铁溶液1.7ml，混匀，静置50分钟，弃上清，取沉淀物约40～50ml，置50～100ml2×碱胨水增菌液中，35℃～37℃培养6～8小时后接种至TCBS或其它选择性平板样品前处理1.水样标本的前处理•来自海洋和河口的水样，因其含有大量的其它弧菌，而这些弧菌在碱胨水中和TCBS平板上与霍乱弧菌生长得一样好。这些标本应作倍比稀释，使成10-1、10-2、10-3，以减少竞争性微生物。然后将碱胨水放在42℃增菌，以抑制一些竞争者的生长，尤其是在该温度下生长得不好的其它弧菌。相反，淡水和生活污水在放入42℃培养前则不需要进行稀释特别脏的水体•首先将10mL水样加入90mL碱性蛋白胨水中，使成10-1，然后再作系列稀释，制成10-2和10-3，将三个稀释度的水样分别置于37℃增菌培养6～8h。有条件时或检测需要时、还可制备平行样，然后将三个稀释度的水样分别置于42℃增菌。样品前处理2.水生动物标本处理•贝壳类可取壳内软组织，剪碎后，连同壳内液体一起搅拌混匀。取25克此混合物加入225ml碱胨水中（10-1），再用碱胨水连续制备10-2、10-3两个稀释度，3管均置于35℃～37℃培养6～8小时，有条件的实验室可制备平行样分别置于42℃增菌培养•鱼类则剖取腮部和肠内容物，用碱性蛋白胨水（pH9.2）制备成10-1、10-2和10-3三个稀释度，均置于37℃培养6h以上（或过夜增菌）。有条件的实验室可以做平行样，分别放在37℃和42℃培养。样品前处理2.水生动物标本处理•因为牡蛎肉的某些成份对于O1群霍乱弧菌有毒性，因此一次只能处理少量牡蛎样品（10～12只），并且要尽快稀释，这样既能稀释其它微生物还能削弱牡蛎肉的杀菌作用•有条件的实验室可以做平行样，分别放在35℃～37℃和42℃培养。42℃增菌可以大大增加分离霍乱弧菌的机率，对于牡蛎样品更是强烈推荐此法24小时pH4℃室温37℃O1O139O1O139O1O1396.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1052.0------------2.6------------4.0++++------------6.3++++34个菌+++++++++++6个菌+++++++++-++++--7.2*++++7个菌++++15个菌++++-++++3个菌----8.4++++×++++×++++×++++×++++×++++-×注：++++：无法计数；+++：无法计数，但散在单个菌落较多；++：菌落大都以单个散在形式存在，个别菌落粘连在一块；+：能够计数；×：未接种平板；*：10倍浓缩的PBS48小时pH4℃室温37℃O1O139O1O139O1O1396.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1054.0++++×-×-×-×-×--6.3++++4个菌++++++++++1个菌++++++++-3个菌-7.2*++++3个菌++++++++++++-++++-1个菌----8.4++++++++++++++++++×××-注：++++：无法计数；+++：无法计数，但散在单个菌落较多；++：菌落大都以单个散在形式存在，个别菌落粘连在一块；+：能够计数；×：未接种平板；*：10倍浓缩的PBS96小时pH4℃室温37℃O1O139O1O139O1O1396.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1056.4×1086.4×1041.7×1091.7×1054.0--×××××-××××6.3++++3个菌++++++++++1个菌++++++++++---7.2*++++1个菌++++65个菌+++-10个菌-----8.4++++×++++×++++×++++×++×16个菌×注：++++：无法计数；+++：无法计数，但散在单个菌落较多；++：菌落大都以单个散在形式存在，个别菌落粘连在一块；+：能够计数；×：未接种平板；*：10倍浓缩的PBS谢谢