DNA重组技术的基本工具

DNA重组技术的基本工具工欲善其事,必先利其器.想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢?实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?基因工程的概念•基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物抗虫害的玉米转鱼抗寒基因的番茄转基因鲑鱼基因工程产品转黄瓜抗青枯病基因的甜椒乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)DNA重组技术的基本工具1.手术刀(基因的剪刀)------准确切割DNA2.缝合针(基因的针线)-----将DNA片段再连接起来3.运输工具(基因的运载体)------将体外重组好的DNA导入受体细胞分子手术刀------限制性核酸内切酶(限制酶)A.来源:主要从原核生物中分离纯化想一想:1.这类酶在原核生物中起什么作用?2.为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？B.作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开.C.识别序列的组成:大多数由六个核苷酸组成D.切割后产生的DNA片段末端的形式黏性末端平末端限制性内切酶限制酶黏性末端和平末端DNA连接酶——“分子缝合针”•连接酶有两种：一种是从大肠杆菌中分离得到的，称之为E·coli连接酶。另一种是从T4噬菌体中分离得到，称为T4连接酶。•这两种连接酶催化反应基本相同，都是连接双链DNA的缺口，而不能连接单链DNA。•E·coli连接酶只能连接黏性末端；T4连接酶既可“缝合”黏性末端，又可“缝合”平末端。DNA连接酶——“分子缝合针”•DNA连接酶与DNA聚合酶一样吗？为什么？答：不是一回事。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。巩固练习总结规律限制酶所识别的序列有什么特点？无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)…CTGCA(2)…AC(3)GC……G…TGCG…（4）…G(5)G…(6)…GC…CTTAAACGTC……CG(7)GT…(8)AATTC…CA…G…你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？基因的载体——“分子运输车”载体必须具备的条件：1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害载体的作用：1、将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进行大量复制。常用的载体有：质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等质粒质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是一种裸露的，结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自主复制的很小的环状DNA分子，大小只有普通细菌拟核DNA的百分之一。要对天然质粒进行人工改造1、下列不适合用于基因工程的运载体是（）A、质粒B、噬菌体C、细菌D、病毒选我C2、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”选我D审题3、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的是（）A、①②B、①③C、①④D、②③TCGAGCTTAAAGGTTCCAAGCTTCAGAATTCG③①②④4、下列哪一种酶是基因工程的工具酶（）A、DNA连接酶B、DNA酶C、RNA酶D、运载体选我AA记住了1.原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。2.迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵.