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RNA-seq技术原理及应用报告人：柳晓东2012.4.16•1、RNA-seq技术简介•2、RNA-seq技术原理•3、RNA-seq技术优势•4、RNA-seq技术应用•5、RNA-seq发展前景一、RNA-seq技术简介RNA-Seq(RNAsequencing)，即RNA测序又称转录组测序，就是把mRNA，smallRNA和non-codingRNA（ncRNA）全部或者其中一些用高通量测序技术进行测序分析的技术。转录组的含义：•转录组是指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和,主要包括mRNA和非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)。•转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，是解读基因组功能原件和揭示细胞及组织分子组成所必需的。有关ncRNA的一些知识：非编码RNA(ncRNA)主要包括有以下几种：转运RNA(tRNA)，核糖体RNA(rRNA)，小核RNA(snRNA)，核仁小分子RNA(snoRNA)，细胞质小分子RNA(scRNA)，不均一核RNA(hnRNA)及小RNA(microRNA,miRNA)等。非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构的影响，对RNA加工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响。所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对ncRNA的分析，并且发现了许多新的ncRNA。二、RNA-seq技术原理RNA-seq实验流程图首先，我们获得细胞总RNA，然后根据实验需要，比如是需要测mRNA，ncRNA还是smallRNA等，对RNA样品进行处理。处理好的RNA再进行片段化，然后反转录形成cDNA，获得cDNA文库，然后在cDNA片段的两端接上接头，最后用新一代高通量测序依进行测序。高通量测序•高通量测序技术（High-throughputsequencing）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，每一次序列测定的读长一般较短的测序技术。•高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(nextgenerationsequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。三种高通量测序简介：•自2005年以来,以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生。之后HelicosBiosciences公司又推出单分子测序(Singlemoleculesequencing,SMS)技术。三种高通量测序技术的优缺点高通量测序中重要名词解释•1、测序深度：测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深度为10×。•2、覆盖度：测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中高GC含量，重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装的序列往往无法覆盖所有的区域，这些区域就叫做Gap。二者的关系：测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制均得以保证。•3、RPKM（readsperkilobasepermillionreads）是每百万读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数。其公式为:•其中，totalexonreads指映射到某个基因上的reads数，mappedreads指map到所有基因的总的reads数。•RPKM不仅对测序深度作了归一化，而且对基因长度也作了归一化，使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表达水平估计值具有了可比性，是目前最常用的基因表达估计方法。三、RNA-seq技术优势•相对于传统的sanger测序法，RNA-seq具有以下优势：•1、数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。•2、高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。•3、任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。SAGE,serialanalysisofgeneexpression,基因表达系列分析MPSS,massivelyparallelsignaturesequencing,大规模平行信号测序四、RNA-seq技术应用•1、转录本结构研究利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰富基因注释的很多方面内容,包括5′/3′边界鉴定、UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq还可对可变剪接(Alternativesplicing)进行定量研究。•2、转录本变异研究在发现序列差异方面，如融合基因鉴定、编码序列多态性研究等，RNA-seq也具有很大的潜力。•3、非编码区域功能研究转录组学研究的一个重要方面就是发现和分析ncRNA。ncRNA按其功能可分为看家ncRNA和调节ncRNA。前者通常稳定表达,发挥着一系列对细胞存活至关重要的功能,主要包括转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)及小核仁RNA(snoRNA)等；后者主要包括长链ncRNA(lncRNA)和以microRNA为代表的小ncRNA(smallncRNA),在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控基因表达。•4、基因表达水平研究相比于传统的芯片技术，RNA-Seq技术能更准确地确定细胞中RNA的表达水平。原则上，RNA-Seq有可能确定细胞群中的每一个分子的绝对数量，并对实验之间的结果进行直接比较。RNA-Seq一个特别强大的优势是它可以捕捉不同组织或状态下的转录组动态变化而无需对数据集进行复杂的标准化。•5、低丰度全新转录本的确定虽然利用转座子标签和芯片技术能够获得全新的转录本，但是其工作量大，结果不确定。而RNA-Seq不受背景噪音问题的困扰，结果准确性高，因而被用来发现全新的转录本。近年来对酿酒酵母、栗酒裂殖酵母、拟南芥、水稻、小鼠、人、和人体白色念珠菌的转录组测定结果都显示出大量的新转录区域，并且其中许多转录水平都低于已知的cDNA基因。RNA-seq测序数据的分析五、RNA-seq发展前景•由于RNA-seq相对于传统的测序方法具有明显的优势，所以被广泛运用到差异基因表达分析，新转录本发现，可变剪切研究等方面。并且随着技术的进步，成本的降低，其应用也越来越广泛。近年来，由RNA-seq技术测序而发表的文章越来越多，而且对于测序结果进行分析的软件也也越来越丰富，相信在不久的将来，RNA-seq技术能够获得相当大的普及。