烟草及烟草制品 西柏烷二萜醇的测定

烟草及烟草制品西柏烷二萜醇的测定气相色谱-质谱联用法研究报告项目组2012年7月烟草及烟草制品西柏烷二萜醇的测定气相色谱-质谱联用法1概述烟叶的吃味品质主要受化学成分、物理性状等因素影响，其中化学成分作为物质基础是决定性因素。多年来，烟草化学家试图从烟草化学成分含量及其相互关系得到评价烟草品质的客观指标，如还原糖、总糖、烟碱、总氮、淀粉、石油醚提取物等常规指标。人们对烟叶香味成分和致香前体物质的研究发现，与常规化学成分相比，烟草表面物质包括二萜、糖酯等组分的含量对烟草香味品质具有更重要作用。洗涤去除烟叶表面物质后烟叶香味和吃味明显减弱，同时增加了苦涩味。而将烟叶表面物质加回洗涤后的烟叶上，烟叶的香味和吃味即可恢复。西柏烷二萜醇是烟草表面物质的主要成分，文献报道鲜烟叶中西柏烷二萜醇含量占叶面总脂类物质的50%，可占叶鲜重的0.7%。烟草表面含量较高的西柏烷二萜醇的结构如图1所示，化学名分别为α(β)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(α(β)-cembrenediol，α(β)–CBD)。α–CBD和β–CBD为差向异构体，α–CBD的绝对构型为(1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇，β–CBD的绝对构型为(1S,2E,4R,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇。西柏烷二萜醇在调制、陈化以及燃烧过程中容易发生氧化和降解，产生多种降解产物，如茄酮、茄醇和降茄二酮等，而这些降解产物被认为是非常重要的烟草香味成分。西柏烷二萜醇的含量和烟草的品质被普遍认为成正相关关系。添加有西柏烷二萜醇的卷烟与对照样相比具有可可香味，余味干净，吃味丰满，较高含量的添加可产生轻微的花香韵，较低含量的OHOHH135791113151617181920OHOHH135791113151617181920图1(1)α-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇(2)β-2,17,11-西柏烷三烯-4,6-二醇添加则产生淡薄的粉香韵。鉴于西柏烷二萜醇等烟叶表面化合物的重要性，一些分析方法被开发出来用于烟叶表面化合物的检测。其中，气相色谱应用最为广泛。采用的检测器有火焰离子化检测器（FID）和质谱检测器(MS)。但是α-CBD和β-CBD是差向异构体，需要经过衍生化之后才能在色谱柱上分离开，否则，两种异构体会于同一保留时间流出，因此用气相色谱分离α-CBD和β-CBD通常需要衍生化处理。目前报道的衍生化方法主要有两种：第一种是以N,O-bis(trimethyl)trifluoroacetamide(BSTFA)为衍生化试剂，二萜上的活泼氢被三甲基硅取代。第二种是利用丁基硼酸和吡啶于100°C加热15min衍生化α-CBD和β-CBD，硼酸的两个羟基与这两种西柏烷二萜的两个羟基脱水反应。2004年，结合国家局科技项目《烟草表面重要二萜类物质与烟草品质特征关系的研究》，郑州烟草研究院通过三年的研究工作，对烟草表面化合物进行了全面系统的分析，在国内首次提取了烟草表面二萜类化合物的纯品并采用质谱和核磁共振技术对其结构进行了鉴定；建立了烟草主要表面化合物的定量分析方法，并对烟草表面物质与烟草品质特征的关系进行了研究。在该项目中建立了一种利用GC/MS技术应用于烟草中两种西柏烷二萜（α-CBD和β-CBD）分析的BSTFA衍生化分析方法。在该项目研究基础上，本项目组对分析方法进行进一步优化、验证，建立了一种测定烟叶表面主要致香物质前体西柏烷二萜醇的可靠方法。2.实验2.1.仪器与试剂HP6890/5973型气相色谱－质谱联用仪；色谱柱：DB-5MS柱，规格为30m×0.25mm×0.25µm；二氯甲烷（分析纯）；二甲基甲酰胺(DMF，分析纯）；正十七烷醇，N,O-双三甲基三氟乙酰胺(BSTFA)(美国AcrosOrganics公司，纯度98%)、α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(自制，纯度97%)、β-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(自制，纯度95%)。2.2溶液配制2.2.1内标溶液的配制准确称取约250mg正十七烷醇到50mL的容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，该溶液为内标溶液。2.2.2α-CBD和β-CBD标准溶液的配制分别准确称量约30mgα-CBD和10mg的β-CBD置于10mL棕色容量瓶中，加入二氯甲烷溶解并稀释至刻度，该溶液为储备液。分别准确移取40μL、100μL、200μL、400μL、800μL、1600μL的储备液至10mL棕色容量瓶中，再准确加入200μL内标储备液，稀释至刻度，此六个标准溶液为系列标准溶液。2.2.3提取溶液配制准确移取2.00mL内标储备溶液至1000mL容量瓶中，用二氯甲烷稀释至刻度，得到提取溶液。2.3样品处理和分析2.3.1样品处理准确称取0.5g烟末(精确至0.001g)，置于100mL锥形瓶中，加入50mL提取溶液，超声振荡10min后，用装有5g无水硫酸钠的滤纸滤去烟末。取10mL滤液至浓缩瓶中，在500mba，40℃的条件下浓缩去除溶剂。加入1000μL1:1(v/v)BSTFA:DMF，洗涤浓缩瓶器壁，将所得溶液转入色谱瓶。在75℃水浴中进行衍生化反应60min，得到GC/MS分析样品溶液。2.3.2气相色谱-质谱条件——进样口温度：250℃；——电离方式：EI；——离子源温度：230℃；——传输线温度：280℃；——进样量：1µL；——分流进样，分流比：10:1；——载气：氦气，恒流模式，流量1mL/min；——程序升温：初始温度150℃，以20℃/min的速率升温至215℃，再以0.5℃/min的速率升至220℃，最后以10℃/min的速率升至290℃，在290℃后运行20min。——扫描方式：选择离子监测（SIM）；——选择离子：内标离子m/z=313；α萜醇和β萜醇离子m/z=169。每个离子的监测时间为50ms。3.结果与讨论3.1烟草中主要二萜和蔗糖酯的定性由于标准质谱库中没有衍生后的α-CBD和β-CBD的标准谱图，通过与纯品的保留时间和MS谱图比较对烟草样品中α-CBD和β-CBD进行定性确认。图1α-CBD和β-CBD衍生后的总离子流图（1.α-CBD2.β-CBD）图2烟草样品的总离子流图图1为α-CBD和β-CBD标准样品衍生后的总离子流色谱图，在10.69和11.81min两处的色谱峰分别是α-CBD和β-CBD。图2为烟草样品的总离子流色谱图，可以看出烟草样品在10.69和11.81min处也存在两个典型的色谱峰。50100150200250300350400450050000100000150000200000250000300000350000400000450000m/z--AbundanceScan656(10.715min):4.D731691432312111179343269191317360435292407250339381图3α-CBD标准品(衍生化)质谱图501001502002503003504004500100000200000300000400000500000600000700000800000m/z--AbundanceScan653(10.689min):1-1.D731691432312111179343269191360317435292407250339381图4烟草样品10.7min处的质谱图501001502002503003504004500100000200000300000400000500000600000700000800000900000100000011000001200000m/z--AbundanceScan782(11.798min):6.D731692311432111174393317191360265291407435339380图5β-CBD标准品(衍生化)质谱图50100150200250300350400450020000400006000080000100000120000140000160000180000200000220000240000260000280000m/z--AbundanceScan783(11.807min):1-1.D731692311432111174393317191360265291435407339380图6烟草样品11.8min处的质谱图图3为α-CBD标准品衍生化后的质谱图，图4为烟草样品相同保留时间（10.7min）色谱峰的质谱图。由质谱图可以看出，二者的主要碎片离子和相对丰度高度一致，可以认为烟草样品色谱图中10.7min处的色谱峰为α-CBD的衍生物。同样，图5为β-CBD标准品衍生化后的质谱图，图6为烟草样品相同保留时间（10.8min）色谱峰的质谱图，二者的主要碎片离子和相对丰度高度一致，可以认为烟草样品色谱图中11.8min处的色谱峰为β-CBD的衍生物。3.2样品处理条件优化3.2.1衍生化条件的选择3.2.1.1衍生化介质的选择衍生化介质是衍生化反应的的外部环境，衍生化介质必须要对衍生化试剂和被衍生化物质具有良好的溶解性，因此衍生化介质的选择直接关系到衍生化反应的进行。结合文献报道，选用二甲基甲酰胺、三氯甲烷和甲苯3种衍生化介质进行比较，结果如表1：表1不同衍生化介质对衍生化反应的影响a目标物三氯甲烷二甲基甲酰胺甲苯α-CBD1.0311.8920.238β-CBD0.0660.5660.062注：a表中数据为目标化合物与内标峰面积之比，下同。表1结果表明，不同的衍生化介质对衍生化效果影响较大。在选择的三种介质中，二甲基甲酰胺的衍生化效果要明显好于三氯甲烷和甲苯。因此，本实验选二甲基甲酰胺作为衍生化的介质。3.2.1.2衍生化介质与衍生化试剂比例的选择一般情况下，加入的衍生化试剂的量越大衍生化效果越好。固定衍生化介质与衍生化试剂的总体积为1000μL，改变两者的量得到不同衍生化介质与衍生化试剂的比例。考察了35:15、30:20、25:25和20:30(v/v)对衍生化反应的影响，结果如表2：表2不同衍生化介质与衍生化试剂的比例(v/v)对衍生化反应的影响目标物35:1530:2025:2520:30α-CBD1.4721.4901.7921.788β-CBD0.4170.4280.5260.515由表2可以看出，随着衍生化介质与衍生化试剂比例的减小，衍生化的效果逐渐变好。综合考虑两种目标物的衍生化效果，当两者的比例为25:25时，衍生化效果最好。因此，本实验选衍生化介质与衍生化试剂比例为25:25。3.2.1.3衍生化温度的选择衍生化温度是影响衍生化反应的一个重要因素。衍生化温度过低，衍生化反应速率太慢，反应时间过长。衍生化温度过高，可能会引起衍生化试剂或被衍生化物质的分解。分别选45℃、55℃、65℃、75℃、85℃、95℃衍生化温度进行比较，结果如表3：表3不同衍生化温度对衍生化反应的影响目标物45℃55℃65℃75℃85℃95℃α-CBD1.2841.5381.7921.8211.6941.668β-CBD0.1600.3300.5260.5400.5550.493由表3可以看出，随着衍生化温度的升高，衍生化效果逐渐变好，当温度达到75℃时，衍生化效果最佳。因此本实验选衍生化温度定为75℃。3.2.1.4衍生化时间的选择一般情况下，衍生化时间越长衍生化进行越完全，衍生化效果也就越好。选15min、30min、45min、60min和75min衍生化时间进行比较，结果如表4：表4不同衍生化时间对反应的影响b目标物15min30min45min60min75minα-CBD1.6761.7651.8901.8921.890β-CBD0.5080.5390.5740.5660.567由表4可以看出，衍生化时间对衍生化反应影响并不显著。随着衍生化时间的增加，衍生化效率缓慢升高。衍生化时间大于60min时，衍生化效果好且趋于稳定。因此，本实验选衍生化时间为60