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第三章微生物资源的多样性与微生物新药的发现第一节稀有放线菌是产生微生物新药的重要源泉第二节黏细菌是一类值得关注的微生物新资源第三节从植物内生菌中筛选微生物新药第四节从海洋微生物中筛选微生物新药第一节稀有放线菌是产生微生物新药的重要源泉所谓的稀有放线菌（rareactinomycetes)即为除链霉菌属外的其它属的放线菌。稀有放线菌是产生微生物新药的重要源泉到1974年止，放线菌来源的抗生素几乎都是由链霉菌属产生的（约占2000种抗生素中的95%）。但在随后6年的报导中，由放线菌产生的仅占25%。事实证明，稀有放线菌是发现新抗生素的极好来源，且它们产生各种不同抗生素的能力不亚于链霉菌属。同样，细菌和霉菌也仍是产生新的生理活性物质的源泉，特别是近年来从霉菌的代谢产物中发现新的生理活性物质的数目正在不断增加。小单孢菌能产生独特化学结构的生物活性物质能产生独特化学结构的生物活性物质。近年来从小单孢菌中发现了引人注目的结构新颖的烯二炔类抗肿瘤抗生素calicheamicinγ1（结构如图所示），由棘孢小单孢菌Ｍ.echinosporaspcalichensis所产生，与肿瘤细胞作用时,分子中烯二炔部分起“分子核弹头”作用，三巯基部分起“扳机”作用，寡糖部分起“识别”作用，能选择性地结合并切除ＤＮＡ双链中的特定片段，如ＴＣＣＴ、ＴＣＴＣ和ＴＴＴＴ。Calicheamicinγ1的化学结构小单孢菌能产生独特化学结构的生物活性物质碳黑小单孢菌Ｍ.carbonacea产生强效的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的寡糖类抗生素ziracin(如图3－所示)。它对甲氧西林和万古霉素耐药菌作用很强。对甲氧西林敏感和耐药的肺炎链球菌的ＭＩＣ为0．032～0．125μｇ/ｍｌ，对青霉素Ｇ耐药菌的ＭＩＣ为0．125～8μｇ/ｍｌ，对万古霉素敏感和耐药菌的ＭＩＣ为0．45～2μｇ/ｍｌ。ＥＤ50为2．5ｍｇ/ｋｇ。静注剂量1ｍｇ/ｋｇ的血浓度为10μｇ/ｍｌ。虽已进入Ⅲ期临床试验，但没有获得ＦＤＡ批准。除产生抗生素外，小单孢菌还产生许多非抗生素的生物活性物质。Ziracin的化学结构游动放线菌(Actinoplanesp.)ATCC3076产生的抗细菌抗生素雷莫拉宁。黏细菌一类值得关注的微生物新资源Epothilons是由粘细菌纤维束菌(Sorangiumcellosum)产生的新型细胞毒化合物。它是一种新的16元环多酮大环内酯,含有一个噻唑基和环上的一个环氧结构(结构如图所示)。该菌产生Ａ和Ｂ两种主要组分、Ｃ～Ｆ四种次要组分以及36种极微量成分。Epothilons的化学结构从植物内生菌中筛选微生物新药要利用植物内生菌这一资源丰富的宝库，首先要将内生菌从植物中有效地分离出来，然后应用分离色谱层析等生物分析方法从内生菌培养物滤液中分离并鉴定出令人感兴趣的生物活性物质，如：紫杉醇、cryptocin、oocyclin、isopestacin、pseudomycin和ambuicacid等。本文主要阐述了植物内生菌分离的一般规则，其生物活性代谢产物的最新研究进展，以期读者对植物内生菌的重要性有更深刻的认识。天然药物的筛选已成为现今的一个研究热点，植物是天然药物的主要来源之一。生活在植物组织中的植物内生菌，由于其与植物的关系密切，同时其产生的丰富多样的次生代谢产物具有多种生物活性，因此从中发现新的有意义的化合物的潜力相当大，其作为新的治疗药物或前体药物的潜在来源已经引起人们的广泛重视。一、历史概况1898年Vogl从黑麦草的种子中首次分离出第一株内生真菌。但在此后的70年间，内生菌的研究进展缓慢；直到70年代，Bacon等人发现高羊茅中的内生真菌和毒素的产生有关，从此以后植物内生菌的研究在国际范围内引起了广泛的重视。二、植物内生菌目前较常用的宽泛实用性概念：植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌和细菌，被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。即我们可以把植物内生菌理解为植物组织内的正常菌群，它们不仅包括了互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括了那些潜伏的宿主体内的病原微生物。三、植物内生菌的生物多样性1.宿主植物种类多样性2.内生菌自身种类多样性3.内生菌在植物组织中分布多样性内生菌普遍存在于目前已研究过的各种陆生及水生植物中。目前全世界至少已在80个属290多种禾本科植物中发现有内生真菌。自20世纪70年代后期，内生菌在一些重要的经济林木如针叶类的各种冷杉、云衫、红杉、紫杉、松柏等以及阔叶的桉树、栎树、桦树、桤木等植物树皮、枝叶中相继被发现并得到了广泛的研究。进而在多种灌木、草本植物以及栽培作物、果树甚至藻类、苔藓和蕨类植物中也发现了内生菌。对于一种植物而言，从中可分离到的内生真菌和细菌通常为数种至数十种，有的甚至多达数百种。在热带雨林植物中，内生菌的多样性更为突出。例如：Anorld等人最近分析了巴拿马中部雨林中两种植物叶子中的内生菌，结果发现分离自83片健康叶子上的内生菌可多达418个形态学种主要内生真菌子囊孢子类：核菌纲盘菌纲腔菌纲广泛分布的种属：半壳霉属拟隐孢霉属拟茎点霉属叶点霉属常见内生细菌大多数为土壤微生物类群：假单孢菌属芽孢杆菌属肠杆菌属土壤杆菌属内生真菌的菌丝生长于植物组织的细胞间，分布于叶鞘、种子、花、茎、叶片和根。其中叶鞘和种子的菌丝含量最多而叶片和根的含量极微。四、植物内生菌的作用1.促进宿主植物的生长2.增强宿主植物的抗逆性3.产生具有生理活性的代谢产物1.内生菌能产生IAA等植物生长激素2.内生菌增强宿主植物对氮、磷等营养元素的吸收如：禾本科农作物上的内生细菌具有很强的固氮能力。感染内生真菌的牧草对氮、磷的摄取能力也有所提高。感染内生菌的宿主植物对环境具有很强的抗逆性，如抗干旱、抗病原细菌和真菌、抗线虫、阻抑昆虫和食草动物的采食等。在内生菌中，有对宿主植物体内某些活性成分的形成有重要影响者，也有产生和宿主植物相同或相似的生理活性成分。五、植物内生菌产生的生理活性物质1.抗生素类物质2.抗肿瘤活性物质3.植物生长调节物质4.杀昆虫物质5.其他类型的活性产物1.抗生素类物质随着细菌耐药性的出现激发了人们寻求更多更好的抗菌素；同时，由于艾滋病和器官移植引起的真菌感染人数不断增加，对于高效抗真菌制剂的需求也不断增强；加之目前治疗原生动物寄生感染药物的匮乏，寻找更新更有效的治疗药物来解决这些问题已迫在眉睫。以往，抗生素的主要来源是土壤微生物。而今，植物内生菌这一多样性十分丰富却尚未开发的微生物类群看来是一巨大资源刺盘孢属内生菌Colletotrichumgloeosporicoides产生的ColletotricacidHOOMeOOHOHOOOOH抗微生物活性内生菌Colletotrichumsp产生的NCOOHH1OCOCH3OHHHHO2OCOCH2C6H5OHHHHO36-isopenylindole-3-carboxylicacid3β,5α-dihydroxy-6β-acetoxy-ergosta-7,22-diene3β,5α-dihydroxy-6β-phenylacety-loxy-ergosta-7,22-diene抗微生物活性，对人畜和植物病原真菌和细菌有良好抑制作用内生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina产生的新型环肽抗生素cryptocandinOHNHOHNOHNHNH(CH2)14OHHNNNHOHN2OOOOOOOOOHHO4,3-Dihydroxy-homotryosine4-Hydroxy-prolineThreoninePalmiticacid4,5-Dihydroxyornithine3-Hydroxy-4-hydroxymethyl-proline对癣菌及白色念珠菌等人类病原真菌具有强烈抑杀作用其MIC与临床应用的抗真菌药amphotericinB相当，具有良好开发前景内生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina产生的酰胺类生物碱cryptocinCH3CH3OOOCH3HCH3HCH3HOH对稻瘟病菌及其他多种植物病原真菌具有很强的抑杀作用内生菌Cytonaemasp.产生的CytonicAcidA(1)和CytonicAcidB(2)OHOOHOOHOHOOOHO1OHOOHOOHOHOOOHO2抑制人细胞肥大病毒组装镰孢霉属内生真菌Fusariumsp.CR377产生的一种新型的酮内酯（pentaketide）化合物OCH3H3COHCH2OOCH3对白色念珠菌有较强活性内生真菌FungusCR115产生的一个二萜化合物GuanacastepeneAOOH3CCH3HOOHH3CCH3H3CO对多种革兰氏阳性和阴性细菌和白色念珠菌有活性内生菌Geniculosporiumsp.产生的Geniculol(1)和CytochalsinF(2)OOOOHH3CHH3COHCH3HO1HNHHOHOOOHO2杀藻剂内生真菌Pestalotiopsisjesteri产生的新的环己烯酮环氧化合物JesteroneOHOHOHHHH对引起大多数植物致病的致病真菌有选择性活性内生菌Pestalotiopsismicrospora产生的AmbuicacidH3CHHOHOHHOHHHOHHHCH3COOH抗真菌剂内生菌Phomasp.NRRL25697产生的5种新的化合物PginadecakubsA-D(1-4)&PginaoebtebibeA(5)具有抗革兰氏阳性菌活性R1OOHOR21R1=R2=H2R1=OH;R2=Ac4R1=OH;R2=HOOHOR2O3OOHOH5拟点霉属内生菌Phomopsissp.产生的PhomoxanthonesA(1)&B(2)是两个新的氧杂蒽酮二聚体OOOHOOHOAcCH3AcOOAcOHOHOOAc1OOHOOHOOAcCH3OAcOHOHOOAcCH3AcO具有显著的抗疟疾和抗结核活性分离自锡兰桂小枝的内生菌Muscodor，其所释放的挥发性物质（醇，酯，酮，酸和脂）对人及植物的致病真菌和细菌有很强的杀伤性。分离自欧洲紫杉（Taxusbaccata）的内生真菌Acremoniumsp.产生的白灰制菌素A具有抗真菌活性。分离自欧洲杜松（Juniperuscommunis）的内生真菌Hormonema，从其发酵液中分离出一种新的三萜糖苷对念珠菌属和曲霉属的真菌具有很强的活性2.抗肿瘤活性物质1）紫杉醇（Taxol）紫杉醇是一种以极低含量存在于各种紫杉属植物树皮和树叶中的萜类化合物，临床上是治疗乳腺癌、子宫癌和卵巢癌的良效药物，自1992年投入市场以来，取得了临床疗效和市场效应的极大成功。TaxolNHOOOOHOOHOHOOHOOO1993年美国学者Stierle等人首次从短叶紫杉（Taxusbrevifolia）的树皮中分离出一株内生的真菌新种Taxomycesandreanae，在培养液种能产生紫杉醇和其他紫杉烷类化合物。至今已在短叶紫杉、喜马拉雅红豆衫、欧洲红豆衫、南方红豆衫、云南红豆衫、落羽衫、榧树中分离到了许多种能产生紫杉醇的内生真菌和放线菌。其中内生真菌微孢拟盘多毛孢的紫杉醇产量已初步显示出其商业潜力。HostplantsFungalentophytesFounderandyearTaxusbrevifoliaTaxomycesandreanaeStierleetal.,1993TaxuswallichianaPhomasp.Yangetal.,1994TaxustaxifoliaPestalotiopsismicrosporaLeeetal.,1995TaxuswallichianaPestalotiopsismicrosporaStrobeletal.,1996TaxodiumdistichumPestalotiopsismicrospora