微生物药物学-第二十二章-生物转化的类型和机制

第二十二章生物转化的类型和机制第一节生物转化的定义与研究内容第二节生物转化的基本类型一、还原反应二、氧化反应三、水解反应四、转移和裂合反应第三节参与药物制备过程重要反应酶类的作用机制一、脂肪酶二、环氧化物水解酶三、糖苷化酶第一节生物转化的定义与研究内容生物转化的含义更强调的是：用微生物或酶来进行药物合成（或其他有机合成）过程中的某一步或几步反应，而那些直接来源于微生物的代谢产物是微生物进行“从头到尾”的合成过程。在许多国外文献中经常能够看到的描述这种技术的名词有：microbialtransformation;microbialconversion;BiotransformationBioconversionBiocatalysisenzymation等。微生物(酶)转化是有机化学反应中的一个特殊的分支微生物转化的本质是某种微生物将一种物质（底物）转化成为另一种物质（产物）的过程，这一过程是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应，简言之，即为一种利用微生物酶或微生物本身的合成技术。微生物(酶)转化是有机化学反应中的一个特殊的分支这些具有生物催化剂作用的酶大多数对其微生物的生命过程也是必需的，但在微生物转化过程中，这些酶仅作为生物催化剂用于化学反应。由于微生物产生的这些能够被用于化学反应的大多数生物催化剂不仅能够利用自身的底物及其类似物，且有时对外源添加的底物也具有同样的催化作用，即能催化非天然的反应（unnaturalreactions）。在研究一个微生物（或酶）转化过程时，需要考虑的问题所用转化底物的选择；所用微生物对不同底物转化能力的考察、转化路线或转化反应的选择等；其中最主要的是寻找适合于所设计转化过程的微生物，以及如何来提高这种微生物的转化能力，即提高这种酶活力；再则是发现一种新的酶或一种新的反应以便为设计一个新的微生物转化过程提供一条线索。用于转化的微生物或酶的多样性用于微生物转化的菌株或酶的筛选的范围应该尽可能地广，因为至目前为止已经发现了3000余种能够催化各种化学反应的酶，其中有些酶的催化效果比化学催化剂好；另外，微生物的多样性和其生理生化特性的多样性（它们能够修饰和降解许许多多有机化合物），使我们有可能找到某种微生物或酶来催化某种特定的和所期望的化学反应。第二节生物转化的基本类型一、还原反应脱氢酶被广泛地用于醛和酮羰基以及烯烃碳-碳双键的还原，这种生物转化反应可使潜手性底物转化为手性产物，如图所示。面包酵母醇脱氢酶和马肝醇脱氢酶能催化酮不对称还原，其还原产物仲醇的对映体过量率接近100%。R1R2OR1R2XR3R1R2R1R2OHOHHHR3R2R3HHR2R1XR1X脱氢酶还原型辅酶氧化型辅酶循环系统或或脱氢酶催化的还原反应生物转化中常用的一些脱氢酶脱氢酶名称特异性反应所需的辅酶商品化酵母醇脱氢酶PrelogNADH+马肝醇脱氢酶PrelogNADH+布氏热厌氧菌醇脱氢酶PrelogNADPH+羟基甾体醇脱氢酶PrelogNADH+弯孢菌脱氢酶PrelogNADPH-乳杆菌属的Lactobacilluskefir醇脱氢酶Anti-PrelogNADPH+爪哇毛霉醇脱氢酶Anti-PrelogNADPH-甲单胞菌属醇脱氢酶Anti-PrelogNADPH-二、氧化反应氧化反应是向有机化合物分子中引入功能基团的重要反应之一。生物催化的氧化反应主要由三大类酶：单加氧酶、双加氧酶和氧化酶，它们所催化的反应如图所示。二、氧化反应单加氧酶和双加氧酶直接在底物分子中加氧，而氧化酶是催化底物脱氢，脱下的氢再与氧结合生成水或过氧化氢。脱氢酶与氧化酶相似，也是催化底物脱氢，但它催化脱下的氢与氧化态NAD(P)+结合，而不是与氧结合，这是两者的主要区别。氧化反应表面上看是加氧或脱氢，其本质是电子的得失。单加氧酶、双加氧酶和氧化酶是催化底物氧化失去电子，并将电子交给氧，即氧是电子受体；脱氢酶催化底物失去电子，它将电子交给NAD(P)+，然后还原型NAD(P)H再通过呼吸链或NAD(P)H氧化酶将电子最终交给氧并生成水。Sub+NAD(P)H+H++O2SubO+NAD(P)++H2O单加氧酶辅酶循环Sub+O2SubO2双加氧酶O2+2e-O22-H2O2+2H+氧化酶O2+4e-2O2-2H2O+4H+氧化酶Sub=底物生物催化的氧化反应类型1、单加氧酶催化的氧化反应单加氧酶（mono-oxygenases）可以使氧分子（O2）中的一个氧原子加入到底物分子中，另一个氧原子使还原型NADH或NADPH氧化并产生水（H2O）。单加氧酶在生物催化的手性合成中有着重要的应用，图所示为该酶催化的一些反应类型。单加氧酶所催化的一些反应类型Sub+NAD(P)H+H++O2SubO+NAD(P)++H2O单加氧酶辅酶循环CHCOHHOHOR1R2OR1OR2RORRnXRnXOX=N,S,Se,P底物产物反应类型辅酶类型烷烃醇羟化金属芳香烃酚羟化金属烷基烃环氧化物环氧化金属含杂原子化合物杂原子氧化物杂原子氧化黄素酮酯或内酯Baeyer-Villiger黄素羟化反应是一类重要的氧化反应碳氢化合物中非活泼的C—H键的羟化是一种非常有用的生物转化反应，传统的有机化学合成方法几乎不能进行这样直接的羟化反应。但很多微生物能够直接进行烷烃和芳香烃的羟化反应，其中工业化应用最为广泛的是甾体的羟化反应。环氧化反应手性环氧化合物是一种重要的手性合成前体，可与多种亲核试剂反应产生重要的中间体。单加氧酶催化的烯烃环氧化反应可用于制备小分子环氧化合物，其中有些产物是传统的化学方法所不能制备的。另外，由单加氧酶催化的硫醚的氧化反应也是非常重要的，已经发现了很多能够催化这类反应的微生物。拜尔-维利格反应（Baeyer-Villiger）由单加氧酶催化的另一个非常重要的反应就是拜尔-维利格反应（Baeyer-Villiger）。该反应是指利用过氧羧酸氧化酮生成酯或内酯，这是一个具有很高应用价值的有机合成反应。2、双加氧酶催化的氧化反应双加氧酶（dioxygenases），有称双氧酶，能催化氧分子中的两个氧原子加入到一个底物分子中。这类酶一般含有紧密结合的铁原子，如血红素铁，其催化的典型反应有以下三种（如图所示）。双加氧酶催化的氧化反应Sub+O2Sub还原e.g.NaBH4SubOHSub+O2双氧酶Sub（氢过氧化物）e.g.NaBH4还原Sub(内过氧化物)OOHOHOO2双氧酶OOOHOH+(dioxetane)还原酶2H图7-27双氧化酶催化的氧化反应OOH双氧酶双加氧酶催化的氧化反应双加氧酶催化的反应有烯烃的氢过氧化反应。烯烃可被一种双加氧酶-脂氧酶氧化为脂质氢过氧化物，其对细胞具有毒性，并能引起病变。脂质氢过氧化物能被过氧化物酶还原为醇。大豆脂氧酶能够催化天然的亚油酸的氧化并不有很高选择性，同时对非天然的底物也能够进行同样的催化反应。过氧化物酶过氧化物酶能够催化过氧化氢化许多芳香族胺或酚类化合物，也有的过氧化物酶能够用于特定构型仲醇的制备。同样，由于过氧化酶的立体选择性，此酶还可用于消旋体氢过氧化物的拆分。双加氧酶在能够用于制备顺式环状二醇和顺式环状连二醇，这些手性化合物具有很多的用途。3、氧化酶和脱氢酶的催化反应氧化酶催化电子转移到分子氧中，以氧作为电子受体，最终生成水或过氧化氢。氧化酶有黄素蛋白氧化酶（氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶）、金属黄素蛋白氧化酶（醛氧化酶）和血红素蛋白氧化酶（过氧化氢酶、过氧化物酶）等。其中有些具有重要的应用价值。脱氢酶可以催化氧化和还原双向可逆反应，一般以催化还原反应为主，但根据需要设计反应条件可以使还原反应转化为氧化反应。脱氢酶能够催化多元醇分子中的某一羟基区域选择性氧化，而化学方法需要对多元醇中的其他羟基进行保护和脱保护的反应。另外，某些脱氢酶能够催化消旋体醇对映体选择性地氧化而用于拆分。三、水解反应水解酶（hydrolases，EC3.x.x.x）是最常用的生物催化剂，占生物催化反应用酶的65%左右。它们能够水解酯、酰胺、蛋白质、核酸、多糖、环氧化物和腈等化合物，这些反应的形式如图所示。其中酯酶、脂肪酶和蛋白酶是生物催化手性合成中最常用的水解酶。生物催化的水解反应的类型OOR1ROO-RORR1HORR1OHRCNORO-H2NHNOCO2-H2NCO2-H2NCO2-R2R1R1R2+H2OR1OHH2O++++++2H2ONH3H2O酯酶或脂肪酶环氧化物水解酶腈水解酶蛋白酶糖苷酶(Glc-α-1,4-Glc)n+H2OGlc+(Glc-α-1,4-Glc)n-11、酯水解用于酯水解的酯酶有猪肝酯酶、微生物酯酶（苦草杆菌、产氨短杆菌、凝结芽孢杆菌、豆酱比赤氏酵母和黑根霉等）、具有酯酶活性的蛋白酶（-胰凝乳蛋白酶、苦草杆菌蛋白酶、青霉素酰化酶、米曲霉蛋白酶和灰色链霉菌蛋白酶等），以及脂肪酶（猪胰腺脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、假单胞菌属脂肪酶毛霉属脂肪酶等）。2、环氧化物水解环氧化物是一类重要的有机化合物，是许多生物活性物质合成的原料。环氧化物水解酶能够催化环氧化物进行区域或对映选择性水解，从而通过生物拆分法制备所需构型的环氧化物。生物催化的烯烃环氧化反应也能够直接制备光学纯的环氧化物。用于生物转化的环氧化物水解酶有肝微粒体环氧化物水解酶和微生物环氧化物水解酶。3、腈水解含有腈基的有机化合物是一类重要的原料。天然腈存在于植物、真菌、细菌、藻类、海绵、昆虫甚至哺乳动物中。腈水解可通过腈水解酶和腈水合酶两种不同的酶来实现。脂肪族腈一般先在腈水合酶催化下生成相应的酰胺，然后再经过酰胺酶或蛋白酶水解为羧酸。芳香族、杂环和不饱和脂肪腈一般被腈水解酶直接水解产生羧酸，而不形成中间体酰胺。4、酰胺水解多肽和蛋白质是由氨基酸通过酰胺键（肽键）相互连接形成的大分子。L-氨基酸被广泛用于医药、食品和手性合成中。近年来，一些非天然D-氨基酸被用作手性化合物合成的前体，D苯苷氨酸、D-对羟基苯苷氨酸是-内酰胺类抗生素的常用侧链。4、酰胺水解氨基酸制备一般有微生物发酵法、化学合成法和酶法三种。其中用酶法合成对映体纯氨基酸主要有如图所示的三种方法：水解酶催化消旋体拆分；裂合酶催化不对称氨加成；脱氢酶催化不对称还原胺化反应。COOR1RNHR2H2NCOOHRCOOHORRCOOHDLL脱氢酶水解酶裂合酶R＝烷基、芳基；R1＝Me，Et，NH2，HR2＝酰基酶法制备L--氨基酸的三种方法工业上常用的酰胺水解酶有：酰胺酶（amidase）又称氨基肽酶，其能催化消旋体氨基酸酰胺选择性水解生成L-氨基酸；氨基酰化酶（acylase），其能选择性地催化L-N-酰基氨基酸水解，如这类酶能够催化消旋体N-乙酰色氨酸和N-乙酰苯丙氨酸水解拆分制备L-苯丙氨酸和L-色氨酸；乙内酰脲酶俗称海因酶，这类酶在体内负责催化嘧啶碱基代谢中二氢嘧啶环的水解开环反应，故又称二氢嘧啶酶，常用的海因酶与酰胺酶和酰化酶不同，它优先水解D-型对映体，属D-海因酶；内酰胺酶，其可用于消旋体内酰胺的水解拆分，这些单一对映体的产物是合成很多生理活性物质的重要中间体。四、转移和裂合反应在生物催化中最为常用的酶为氧化还原酶和水解酶，其在催化手性合成反应中约占90%左右。然而，其他四大类酶——转移酶、裂合酶、异构酶和连接酶（合成酶）在生物催化中也有着重要的应用，它们能催化C—C、C—N、C—O以及C==C和C==O等化学键的生成或裂解反应。1、转移反应转移酶（transferases，EC2.x.x.x）是一类常见的生物催化剂，它所催化的转移反应如下式所示。这类酶催化的底物有氨基酸、酮酸、核苷酸和糖等化合物，其中糖基转移酶已被用来制备新型的糖。X—Y+Z转移酶X+Z—Y糖苷化酶（glycosidses）糖苷化酶能催化糖苷键的水解，故又称糖水解酶（glycohydrolases）。该酶不需要任何辅酶，是真正的水