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华东理工大学继续教育学院课程——微生物学第三章病毒与亚病毒前言——1.病毒的最早记载•记载最早的病毒病－天花中国：北宋时期防止天花：牛痘（英国乡村医生詹纳）•18代埃及王朝时代（公元前1500年），浮雕刻有一条萎缩腿的祭司-脊髓灰质炎病毒。给人类带来严重灾难的流感病毒流感期间CampFunston的紧急军事医院前言——2.病毒的发现19世纪末，科学家伊万诺夫斯基在研究烟草花叶病的病因时，推想是由细菌引起的。他将患花叶病的烟草榨出汁液，用细菌过滤器进行过滤，将细菌滤出，再用过滤后的汁液去感染正常的烟叶，结果发现正常的烟叶还能患病。这表明烟草花叶病是由比细菌还小的生物引起的，他把这种生物叫做“滤过性病毒”，就是我们所说的病毒。1971年后，陆续发现了各种亚病毒——类病毒、拟病毒和朊病毒。1935年诺贝尔化学奖得主美国生化学家斯坦利第一次将病毒提纯出来，得到了一些结晶体。这些结晶体表现不出任何的生命特征，但是将这些结晶体移入生物体内，病毒就会大量繁殖，并使生物体致病。至今美国加州大学原斯坦利实验室里保存的他当时提纯的病毒结晶仍然具有致病力。由这些资料可知，病毒是一种特殊生物，只有在其他生物的活细胞内才能生活和繁殖，才能表现出生命现象。离开活细胞后，病毒无法进行任何生命活动。这点也可以用在普通培养基上无法培养病毒来解释。病毒晶体假设病毒有一个篮球那么大，那么细胞就是一座摩天大厦非典（SARS）病毒H5N1禽流感病毒甲型H1N1流感病毒常见病毒手足口病病毒艾滋病病毒：HIV狂犬病病毒花叶病病毒昆虫病毒豌豆萎黄病毒绿脓杆菌病毒常见病毒前言——3.病毒的分类非细胞生物拟病毒:只含不具独立侵染性的RNA组分类病毒:只含具有独立侵染性的RNA组分亚病毒真病毒:至少含有核酸和蛋白质两种组分朊病毒:只含单一蛋白质组分噬菌体（原核生物如细菌、放线菌，噬蓝绿藻体，支原体噬菌体）真菌病毒植物病毒昆虫病毒动物病毒前言——4.病毒的基本特点个体极小（以nm计），能通过滤菌器，形态多样，有球状、杆状、复杂形态。无细胞结构，主要由蛋白质、核酸构成，一个病毒体内仅含一种核酸，核酸以单链或双链形式存在。生活方式为专性活细胞内寄生，病毒酶系不全，离开活体后无生命特征。以毒粒形式存在。病毒以复制的方式增殖。对一般抗生素不敏感，对干扰素敏感。一般来说，特异性比较强。前言——5.什么是病毒？病毒：是一类超显微的非细胞生物,每一种病毒只含有一种核酸;它们只能在活细胞内营专性寄生;在离体条件下,它们以无生命的化学大分子状态存在.12第二节病毒的繁殖方式第四节病毒与实践目录第一节病毒的形态构造及化学成分第三节亚病毒第一节病毒的形态构造及化学成分1.病毒的大小绝大多数的病毒都是能通过细菌滤器的微小颗粒,它们的直径多数在100nm(20～200nm)上下。观察病毒的形态和精确测定其大小,必须借助电镜。2.病毒的形态形态各异的病毒烟草花叶病毒P2噬菌体T2噬菌体脊髓灰质炎病毒疱疹病毒流感病毒腺病毒形态各异的病毒形态各异的病毒（1）典型病毒粒的构造•病毒粒有时也称病毒颗粒或病毒粒子(virusparticle),专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。•病毒粒的基本成分是核酸和蛋白质。核酸位于它的中心,称为核心(core)或基因组(genome),蛋白质包围在核心周围,形成了衣壳(capsid)。衣壳是病毒粒的主要支架结构和抗原成分,有保护核酸等作用。裸病毒包膜病毒（2）病毒的群体形态可以分为两个大类：1）光镜可以观察到：包含体（动植物细胞）2）肉眼可见：噬菌斑（细菌）空斑（动物细胞）枯斑（植物叶片）①病毒的群体形态——包含体包含体（inclusionbody）包含体的特殊名称：顾氏小体-天花内基小体－狂犬X小体－TMV多角体-昆虫包含体的存在位置：多数为细胞质中如天花病毒少数为细胞核中如疱疹病毒噬菌斑的形态与病毒、细菌及培养基的情况有关噬菌体所形成的噬菌斑②病毒的群体形态——噬菌斑③病毒的群体形态——空斑动物病毒感染形成的空斑空斑：动物病毒在宿主单层细胞培养物上形成。④病毒的群体形态——枯斑（3）病毒粒的对称体制•病毒粒的对称体制有三种,以螺旋对称和二十面体对称(等轴对称)为主。另一些结构较复杂的病毒,实质上是上述两种对称相结合的结果,称作复合对称。螺旋对称的代表———烟草花叶病毒烟草花叶病毒简称TMV。由95%衣壳蛋白和5%单链RNA(ssRNA)组成。衣壳含2130个皮鞋状的蛋白亚基即衣壳粒。每个亚基含158个氨基酸,相对分子质量为17500。亚基以逆时针方向作螺旋状排列,每圈为49个核苷酸。二十面体对称的代表———腺病毒•腺病毒(Adenovirus)是一类动物病毒,1953年首次从手术切除的小儿扁桃体中分离到。•腺病毒的外形呈“球状”,实质上却是一典型的二十面体对称。没有包膜。它有12个角、20个面和30条棱。每个五邻体上突出一根末端带有顶球的蛋白纤维,称为刺突。腺病毒的核心是由36500bp的线状双链构成。复合对称的代表———T偶数噬菌体•E.coli的T偶数(eventype)噬菌体共有3种,即T2、T4和T6.它们是病毒学和分子遗传学基础理论研究中的极好材料。•T4由头部(head)、颈部(neck)和尾部(tail)3部分构成。由于头部呈二十面体对称而尾部呈螺旋对称,故是一种复合对称结构。T-偶数噬菌体的头部为一变形的二十面体结构。头部含有双链DNA。其尾部结构复杂,由尾管(tailtube)、尾鞘(tailsheath)、颈部(collar)、基片(baseplate)、尾钉(tailpin)和尾丝(tailfiber)5个主要部分组成。3.病毒的核酸•核酸构成了病毒的基因组(genome),它是病毒粒中最重要的成分,具有遗传信息的载体和传递体的作用。•病毒核酸的种类很多,是病毒系统分类中最可靠的分子基础,主要有以下几个指标:①是DNA还是RNA;②是单链还是双链;③呈线状还是环状;④是闭环还是缺口环;⑤基因组是单分子、双分子、三分子还是多分子;⑥核酸的碱基或碱基对数,以及核苷酸序列等。4、病毒的培养和纯化噬菌体细菌培养物培养液营养琼脂平板细菌培养液变清亮细菌平板成为残迹平板若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，噬菌斑(plague)如同对细菌计数一样，形成的噬菌斑也可用于对噬菌体的数目进行估算。动物病毒实验动物鸡胚多种细胞培养Egg-BasedVaccineProductionCurrentlycommercializedseasonalinfluenzavaccinesrelyuponthesupplyofembryonatedchickeneggsasthesubstrateforviruspropagation.蛋白质提纯方法（盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等）标准纯化的病毒制备物应保持其感染性病毒是有感染性的生物体病毒具有化学大分子的属性纯化的病毒制备物的理化性质应具有均一性方法主要化学组成为蛋白质具有一定的大小、形状和密度差速离心梯度离心（超速离心）第二节四类病毒及其繁殖方式以大肠杆菌的病毒T4噬菌体为例•噬菌体即原核生物的病毒,包括噬细菌体、噬放线菌体噬蓝细菌体等,凡有原核生物活动之处几乎都发现有相应噬菌体的存在。•噬菌体种类很多,可归纳成6种主要形态,即①A型,dsDNA,蝌蚪状,收缩性尾;②B型,dsDNA,蝌蚪状,非收缩性长尾;③C型,dsDNA,非收缩性短尾;④D型,ssDNA,球状,无尾,大顶衣壳粒;⑤E型,ssRNA,球状,无尾,小顶衣壳粒;⑥F型,ssDNA,丝状,无头尾1.噬菌体的繁殖噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。根据噬菌体与宿主的关系：1.烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体.2.温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：即吸附、侵入、增殖、装配和释放烈性噬菌体的繁殖（1）吸附吸附是特异性的，病毒吸附蛋白，细胞受体（2）侵入尾管端携带的少量溶菌酶水解肽聚糖，使细胞壁产生一小孔，注入核酸，而蛋白质外壳则留在细胞的外面。（3）增殖包括核酸的复制和蛋白质的合成。早期基因次早期基因晚期基因（4）成熟或装配•主要步骤有：•DNA分子的缩合——通过衣壳包裹DNA而形成头部——尾丝及尾部的其它部件独立装配完成——头部与尾部相结合——最后装上尾丝，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。（5）裂解（释放）两种释放形式：A.裂解性释放：子代噬菌体成熟后，在脂肪酶和溶菌酶的作用下，细胞裂解，子代噬菌体释放（release）。B.出芽性释放：有包膜的病毒通过出芽或者分泌的方式从细胞中释放。病毒可以从细胞膜、核膜或内质网膜中获得包膜。核衣壳附着于膜的内侧，和膜一起挤出。烈性噬菌体复制的过程一步生长通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成100-300个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长。在固体培养基表面可见噬菌斑。在液体培养基中可见培养物被溶解，培养基变清.2.噬菌体效价的测定•噬菌体效价：每毫升试样中所含有的具有侵染性的噬菌体粒子数。•效价的测定方法：双层平板法（Twolayerplatingmethod)•电镜直接观察3.一步生长曲线定量描述烈性噬菌体（病毒）繁殖规律的实验曲线，以培养时间为横坐标,以噬菌体（病毒）效价为纵坐标称为一步生长曲线.可分以下阶段：潜伏期，裂解期，稳定期三个指标：潜伏期，裂解期，裂解量＝平稳期的平均效价数/潜伏期平均效价数裂解量：平均每一宿主细胞裂解后产生的子代噬菌体数4、温和噬菌体与溶源性细菌（1）温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核基因组上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。（2）原噬菌体（或前噬菌体）：即整合在宿主核基因组上的噬菌体的核酸。（3）溶原性细菌：指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。一般可进行正常生长繁殖,而不被裂解。溶原性细菌的特点：1.可稳定遗传：子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性。2.可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10-2～10-5。可诱导裂解：用化学、物理方法诱导3.具有“免疫性”：对同型噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体没有免疫性。4.可复愈：自然遗失前噬菌体，不发生自发裂解和诱导裂解.5.溶源转变：由于溶原菌整合了温和噬菌体的核酸而使自己产生一些新的生理特征。λ噬菌体裂解性循环与溶源性循环的相互关系自发或诱导温和噬菌体向烈解性循环的转变5.植物病毒叶片黄化枯斑植株矮化植物病毒大多是含单链RNA的病毒。按粒子形态分为3种类型:杆状、线状或近球形的多面体。有些植物病毒也具有包膜。植物病毒和其它病毒一样是严格寄生生物,但它们的专化性不强。动物病毒入侵的三种方式：1.裸病毒直接侵入2.包膜病毒以融合方式进入3.有包膜的病毒以胞吞方式进入6.动物病毒7.昆虫病毒•多角体•昆虫病毒的种类：•核型多角体（NPV)•质型多角体(CPV)•颗粒体病毒(GV)•无包含体病毒第三节亚病毒1.类病毒1.1类病毒的发现：马铃薯纺锤型块茎病（PSTV）病原目前已经鉴定的类病毒种类有20多个，均在植物中发现。结构特点：为单链闭合环状的RNA分子，棒状结构，通常含有246～375个核苷酸。类病毒RNA不编码任何蛋白质PSTV类病毒是一种不含蛋白，能在感染的寄主细胞中自我复制并引起病原的小RNA环状分子，由246~399个核苷酸分子组成，目前只在植物细胞中发现。Fig.Symptomsofviroiddiseases:A:potatospindletu