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实验九、显微镜直接计数•学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法一、实验目的利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。二、实验原理由于计数室的容积是一定的（0．1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。•血球计数板通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，孢子的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。在计数时，通常数五个中方格的总孢子数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总孢子数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算。设五个中方格中总孢子数为A，孢子液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总孢子数：（即0.1mm3的总孢子数)为A/5×25×B因1mL=1cm3=1000mm31mL悬液中的总数=A/5×25×B×1000×10=50000A×B(个)三、实验材料•菌种：黑曲霉孢子悬液•仪器或其他用具：血球计数板、显微镜、盖玻片、毛细滴管四、方法与步骤1.孢子悬液制备2.镜检计数室3.加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，取孢子悬液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，让悬液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满悬液，计数室内不得有气泡。加样加样4.显微镜计数静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。在高倍镜下计数：随机计数五个中格的孢子数，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总孢子数，最后再换算到每mL悬液中的含孢子数。将结果记录于下表中，A表示五个中方格中总孢子数；B表示孢子悬液稀释倍数各中格中菌数AB二室平均值菌数/mL12345第一室第二室5.清洗血球计数使用完毕后，将计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。•实验过程中注意事项（1）保证计数前计数室是干燥、洁净（2）加样位置要准确无误，自然吸进。（3）样品稀释度要求每小格约有5-10孢子体为宜。（4）计上不计下,计左不计右。（5）由于孢子处于不同空间位置，需不断调节焦距观察。•（5）同一个样品，要计数两个计数室，得出平均数来进行计算。•（6）清洗时，切勿用硬物洗刷，洗完后要自行晾干或吹风机吹干。五、作业结果：P55思考题：2