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免疫组织化学技术Immunohistochemistrytechniques病理教研室了解免疫电镜实验原理和方法熟悉标本处理、染色的基本过程,染色对照、结果判定等程序步骤和要求掌握IHC几种常用方法的基本原理，掌握PAP法、ABC法、LsAB法的操作要点.能够结合自己的专业进行科学合理的实验设计学习要求：第一节免疫组织化学技术概述（一）发展简史1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁蛋白标记Ab技术70、80年代多位科学家改良上述技术，建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶（PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC）法使免疫组织化学进入了应用阶段。2000年以后各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。定义:免疫组织化学又称为免疫细胞化学（Immunocytochemistrytechniques）,它是组织化学的分支,它是用标记的特异性抗体对组织内抗原的分布进行组织和细胞原位检测技术,因此又被称为原位免疫学（Insituimmunology).（二）、免疫组织化学的原理它借助于荧光素、酶等标记抗体与组织切片或细胞涂片中相关抗原相结合，由于荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定的显色处理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准确定位欲测定的抗原物质。荧光素、酶标记抗体抗原荧光阳性色彩显微镜观察组织抗原抗体酶荧光素三大系统本技术是应用免疫学原理来识别待测抗原，再通过酶和底物的作用外加显色剂，将上述反应显示出来。免疫组织化学识别系统联结系统显示系统识别系统是指特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是本技术的基本依据。联结系统由联结抗体构成。它的作用是联接识别系统和显示系统。显示系统的目的是使抗原抗体间的特异性结合变为肉眼可见。因此显示系统由标记酶，底物和显色剂组成，以在靶抗原存在位点上形成有色沉淀。特点：特异性强灵敏度高定位准确和简便快速等优点又能够将形态、功能及代谢的研究有机结合起来。①分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断；②证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤；③应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌胚抗原（CEA）对胃肠道癌、甲胎蛋白（AFP）对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助；（三）免疫组化的应用④有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免疫球蛋白轻链κ和λ来鉴别滤泡性恶性淋巴瘤和滤泡性反应性增生；⑤研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙型肝炎病毒、鼻咽癌与EB病毒、宫颈癌与乳头状瘤病毒等的关系；⑥为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺癌检测雌、孕激素受体（ER、PR）呈阳性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗可预期获得较好的疗效；⑦检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-67，PCNA）用来估计肿瘤的预后。免疫组化在临床诊断中应用病例示范（Case1）临床病史资料：48岁，男性，胃活检标本取自胃大弯部位。H&E染色切片描述肿瘤细胞显示在间质中呈癌巢样，邻近的腺体肠上皮化生，间质中的不规则的巢状结构待诊断.H&E染色首先选择Cytokeratin单克隆广谱角蛋白抗体在细胞巢中呈强阳性染色，证明是上皮来源性的肿瘤，在图片顶部是非肿瘤性的腺上皮阳性，肿瘤性的腺体在底部。肿瘤细胞再进一步进行cytokeratin7/cytokeratin20染色，染色证实在肿瘤细胞中同时缺少cytokeratin7/cytokeratin20的表达。在这张图片中肠上皮细胞cytokeratin20阳性与邻近的肿瘤细胞阴性形成明显的对照。cytokeratin7and20在临床中使用中，如果同时都不表达，特异性地表示肿瘤细胞为来源于一些上皮的肿瘤（subsetofepithelialtumors），包括肾细胞癌，前列腺癌、肝细胞癌和神经内分泌肿瘤等。Synaptophysin测定Synaptophysin所有肿瘤细胞中都显示出较强的阳性表达，而在肿瘤细胞中包绕的肠腺体呈阴性诊断:神经内分泌癌Ki-67测定:Ki-67在肿瘤细胞呈现非常低的表达，Ki-67染色同样证实为肿瘤细胞增殖率低，肠腺上皮中Ki-67高表达，可能是胃小凹腺体，与高细胞增殖率的腺上皮相比Ki-67在肿瘤细胞中缺少胞核表达。这些Ki-67标记阴性的肿瘤细胞是低分级的神经内分泌癌细胞，免疫组化在临床诊断中应用病例示范（Case2）临床病史资料：56岁，男性，没有明显的疾病史，因右前脑部额叶急性出血入院，手术清除血凝块，标本送病理科，送检物呈黑褐色约有4X4X4cm脑组织。组织碎片似脑皮质其中含有恶性细胞团，恶性细胞团为大细胞分化的肿瘤，需要考虑的范围有癌、淋巴瘤、黑色素瘤，肉瘤（圆形细胞），因为肿瘤发生在脑部，还需要与恶性胶质瘤鉴别。诊断中的疑问：肿瘤的准确的分类？免疫组化可以解释这些疑问.图片中的肿瘤细胞中CD45和CD43显示阴性，使用CD45和CD43标记是考虑该病例中“大细胞恶性肿瘤细胞”需要与间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)鉴别，具有鉴别意义的CD45显示阴性。图片中的CD43阳性的细胞是浸润的淋巴细胞和巨噬细胞，CD43在肿瘤细胞中也显示阴性。CD43是间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)诊断中很好的一个标记物，其敏感度高。GFAP是中间丝蛋白在胶质细胞和胶质性肿瘤细胞中表达。GFAP在图片肿瘤细胞中没有表达。棕色背景染色是脑皮质中的胶质细胞。角蛋白是上皮细胞和肿瘤细胞的中间丝纤维蛋白，在图片肿瘤细胞中没有表达.HMB45黑色素瘤诊断的“金标准”.在诊断恶性黑色素瘤中已经有多个抗体联合，犹如“梦之队”，HMB45联合tyrosinase和MART1基因产物.诊断：恶性黑色素瘤。（四）组织切片中载玻片的处理抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用Poly-L-Lysine、ZLI-9001APESZLI-9003HistogripTM或ZLI-9005等几种试剂，对已常规清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。多聚赖氨酸APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。(3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷)HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。（五）抗原修复抗原修复是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。石蜡切片为什么要做抗原修复？有那些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽.所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。抗原修复方法一、热修复1、微波炉加热法将玻片分别插入抗原修复盒中，以保证各部位的玻片受热均匀。在抗原修复盒中加入抗原修复液，盖上带有小孔的盖子。将塑料盒置于微波炉中央，加热2x5min。两次加热之间，加入50ml蒸馏水。加热过程中，组织标本不可干燥。第二次处理后，将微波炉中的修复盒移至室温冷却15-20分钟。不要打开盖子！蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶并置于蒸馏水中。用TBS或PBS液冲洗。进行免疫组化染色。在压力锅中放入1500-3000ml抗原修复缓冲液加热到沸腾，不加阀，玻片插入切片架并放入沸腾的修复缓冲液中。后加阀，使之加压2分钟。后将压力锅置于流水槽或继续冷却20分钟（减压）。取出切片，蒸馏水冲洗，移至TBS或PBS液中，以避免组织干燥。以下同微波炉修复法。2、压力锅法抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。二、酶消化方法1、胰蛋白酶处理：A滴加一滴胰蛋白酶工作液于组织上。B室温--37℃孵育20-40分钟，孵育时间的长短依福尔马林固定时间及所测抗原情况而定。C蒸馏水冲洗，终止反应。D阻断内源性过氧化物酶。E免疫组化染色。2、胃蛋白酶处理A滴加胃蛋白酶工作液于组织上。B最佳消化时间取决于福尔马林的固定时间，37℃预热。一般消化10分钟，长至30分钟。C以下同胰蛋白酶处理方法3,4,5。注：过度消化将导致组织结构的丢失，并引起组织脱片三、综合方法微波炉加胰酶修复法：将组织切片置于盛有50ml修复液的塑料盒中，封口膜封口后加热5分钟。冷却后打开，将切片置于37℃预热的蒸馏水中，胰蛋白酶消化。室温胰蛋白酶处理30秒钟。蒸馏水冲洗。阻断内源性过氧化物酶，置蒸馏水中。免疫组化染色。操作中还应注意如下问题：1、热处理后应注意自然冷却。2、热处理时要防止切片干燥。3、应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。4、一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。5、注意形态学结构的改变(一般经高温修复后胞浆会无明显的破坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻)。6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。(五)免疫组织化学的全过程1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。心牵迎评促建情系赣医发展第三节免疫组织化学染色的基本原理能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的特性,称为物质的抗原性（antigenicity）。一.抗原的概念和性质1、抗原的概念凡能在机体内引起体液免疫和（或）细胞免疫反应的物质，称为抗原（antigen，Ag)。（2）反应原性：能与相应抗体发生特异结合；抗原性包括（1）免疫原性：刺激机体产生抗体具备二者为完全抗原，只具后者为半抗原（hapten），如多肽、甾类激素、多糖、类脂质等。抗原的免疫原性是由抗原分子表面特殊的化学活性基团决定的,包括蛋白质的一段氨基酸序列、三维立体构象等，这些部位称为抗原决定簇(基)(antigendeterminant),是抗原与抗体结合的基本单位,也称为表位(epitope)。2.抗原的性质:某种抗原它的决定簇可有一个或多个，由此抗原也可分为单价和多价，如半抗原为一价，完全抗原为多价，BSA有18个决定簇，甲状腺球蛋白有40个决定簇。抗原具有特异性，只与相应的抗体结合，其特异性是由抗原决定簇的性质、数量、空间构型决定的。1、概念:抗体（antibody，Ab）是机体受Ag刺激后由B淋巴细胞的衍生物—浆细胞分泌的一类免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig),可与相应抗原特异性结合。二.抗体的概念、性质、分类每条Ig单体皆由2条相同的重链和2条相同的轻链构成，链间以