土壤中分解尿素的细菌分离和计数

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数微生物的培养与应用细菌脲酶尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3课题背景课题目的土壤中尿素分解菌的分离与计数从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土样中究竟含有多少这样的细菌思考：PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能忍受93℃左右的高温。如果请你来寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找？()A．土壤中B．海水中C．热泉中D．冷库中C如何寻找耐高温的酶？—寻找高温环境；原理：热泉70-80℃的高温条件淘汰了绝大多数的微生物，使得耐热的Taq细菌脱颖而出。选出耐高温细菌后，从耐高温菌种中提取耐高温酶。1、自然界中目的菌株的刷选原理：一、筛选菌株2、实验室中筛选微生物的原理：（纯且活的菌种）在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去找。人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。KH2PO41.4gNaHPO42.1gMgSO4H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？此配方能否筛选出分解尿素的细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。3、方法：利用选择培养基分离选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。(1)在培养基中加入某种化学物质。利用选择培养基分离微生物的方法：例如，加入青霉素可以分离出；加入高浓度的食盐可以得到。酵母菌和霉菌金黄色葡萄球菌这里的加入是在培养成分的基础上加入。(2)改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离；尿素作为唯一氮源时，可以分离出石油作为唯一碳源时，可以分离出固氮微生物能消除石油污染的微生物能分解尿素的细菌(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物本课题使用的培养基的配方如下：成分KH2PO4Na2HPO4MgSO4·7H2O葡萄糖尿素琼脂水含量1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g1000mL请分析后回答：(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是________和________。(2)该培养基为____________培养基(按物理状态分)，理由是______________。(3)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？____________________________________________________________________________。葡萄糖尿素固体有凝固剂琼脂有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长二、统计菌落数目1、方法：常用稀释涂布平板法统计活菌的数目原理：当样品的时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的。为了保证结果准确，一般选择菌落数在统计通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少的活菌。要求：30∼300个菌落的平板稀释度足够高一个活菌例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此统计结果一般用菌落数表示。=（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数。缺点：操作复杂，实验结果有一定的误差。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低每克样品中的菌株数=（C/V)XMC:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。计算公式：显微镜直接计数优点：缺点：计数方便，操作简单死菌、活菌都计算在内，统计结果比实际值偏大（统计菌株数目）1、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（）A一个细菌、液体培养基B许多细菌、液体培养基C一个细菌、固体培养基D许多细菌、固体培养基2、某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）A2.15×108B2.15×109C215D21.53、下列有关检测土壤中细菌总数实验操作的叙述中，不正确的是（）A用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板B取104、105、106倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板C将实验组和对照组平板倒置，37℃恒温培养24h-48hD确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。CBD利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。1、A同学筛选出150个菌落。2、B同学筛选出50个菌落。B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。2、增加实验说服力的措施：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。①设置重复：排除偶然因素对实验结果的影响。在培养过程中同一稀释度下应涂布至少3个平板，才能增强说服力和准确性②设置对照：若对照的培养皿中无菌落生长，说明：方法：方法：观察培养物中是否有杂菌污染如空白对照组培养基未被杂菌感染培养基混入其他杂菌若实验的培养基菌落数偏高或者菌落形态多样，说明：若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目，说明：观察选择培养物是否具有选择作用如完全培养基对照组选择培养基具有筛选作用距地表约3∼8cm土壤层菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养三、实验设计1、实验流程：2、操作流程：（1）土壤取样取样原因：土壤要求：取样部位：土壤“微生物的天然培养基”，含有大量的微生物，数量最大，种类最多。富含有机质，pH接近中性且潮湿。测细菌数：测放线菌：测真菌数：（2）样品稀释稀释原因：稀释标准：稀释倍数：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30-300之间，便于计数。一般用104、105、106稀释液一般用103、104、105稀释液一般用102、103、104稀释液思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？土壤中各类微生物的数量不同如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围可以放宽103-107.1、关于土壤取样的叙述，错误的是（）A土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B先铲去表层土3-8cm左右，再取样C取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D应在火焰旁称取土壤2、下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离”实验步骤排列正确的是①土壤取样②称取10g土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中③吸取0.1ml进行平板涂布④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度A①②③④B①③②④C①②④③D①④②③CC（三）微生物的培养与观察1、接种：用适当的稀释液涂布平板2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d;放线菌:25∼28℃,5∼7d;霉菌:25∼28℃,3∼4d.3、观察：a.每24h统计一次菌落数目b.以“稳定菌落”为观察对象（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是；然后，将水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为。(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是。(3)示意图A和B中,表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高的利用率。