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•WhatisFermentationEngineering?•FermentationEngineeringandMicrobialMedicine•FermentationEngineeringandGeneticEngineering•FermentationEngineeringandBiotechnologyPharmaceuticalFermentationEngineeringFermentationEngineering•发酵与发酵工程•发酵工程的发展•发酵工程的研究内容•发酵工程的展望发酵工业的特征•原料的特征•生产的执行者—微生物•生产过程的特征•生产过程的自动调节•反应的特异性•生产的外部条件—污染问题•与其他工业的比较•其他问题发酵工程中的微生物问题•微生物特性•微生物种类•微生物代谢•微生物遗传•微生物的筛选•菌种的保藏•微生物的培养微生物的特性•分布广泛•种类多•生长繁殖快速•易变异•基因组简单•代谢产物丰富微生物代谢•初级代谢–分解代谢–合成代谢•次级代谢微生物的次级代谢•特点–在微生物生长后期形成–合成期短–参与次级代谢的酶系往往是复合体–次级代谢酶系对底物的专一性不强–次级代谢酶在细胞中有特定的位置•与初级代谢的关系•初级代谢是与生物生存有关的、涉及到产能和耗能的代谢类型。•次级代谢是某些生物为避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。•代谢产物不同。•代谢过程与机体生长过程的关系不同。•产物的性质与类型不同。•对环境条件变化的敏感性或遗传稳定性不同。•催化代谢合成的酶的专一性不同。微生物筛选•方案制定•取样•培养•分离•活性筛选活性筛选的途径和方法遗传育种•随机诱变–物理诱变–化学诱变–生物诱变•定向诱变•杂交–传统杂交–原生质体融合•代谢控制•基因工程诱变的过程•出发菌株的选择•处理菌悬液的制备•诱变处理•中间培养•分离和筛选菌种保藏•保藏的目的•保藏的方法培养问题•种子的培养•生产过程的培养—发酵–发酵的类别–发酵的要素发酵方式•分批发酵：分批培养是一种间歇的培养方式，除了进气、排气和补加酸碱调节pH外，在培养过程中与外界没有其他的物料交换。•补料分批发酵：补料分批培养也是一种间歇的培养方式，与分批培养不同之处在于，在培养过程中需要往发酵液中补加新鲜的营养成分。•连续发酵：连续培养是在连续流加新鲜培养基的同时连续放出发酵液。•透析发酵：该法是用物理方法把对微生物生长不利的代谢废物或发酵产物从培养基中除去的发酵方法。发酵工程中的工艺问题•培养基的影响及其控制–培养基的成分–培养基成分对发酵过程的影响–培养基成分对发酵产物的影响•发酵罐的影响•其他因素–温度的影响及其控制–溶氧的影响及其控制–pH的影响及其控制温度•影响温度的因素•温度对发酵的影响•温度的选择与控制溶氧•影响溶氧的因素•溶氧对发酵的影响•溶氧的选择与控制pH•影响pH的因素•pH对发酵的影响•pH的选择与控制高密度发酵与高表达发酵•影响高密度的因素•实现高密度的方法•高表达发酵微生物药物•什么是微生物药物？–来源于微生物的具有药理活性的物质。–由微生物在其生命活动过程中产生的具有生理活性的次级代谢产物及其衍生物。•微生物药物由什么组成？–微生物的整体或部分实体–微生物的初级代谢产物–微生物的次级代谢产物–微生物合成的产物•抗生素（antibiotic）•酶抑制剂(enzymeinhibitor)•免疫调节剂(immunomodulator)•受体拮抗剂(receptorantagonist)•抗氧化剂(antioxidant)•维生素、氨基酸、有机酸等传统药物(vitamin,aminoacid,organicacid,andothertraditionalpharmaceuticals)•其它生理活性物质(otherbioactivesubstances)：神经保护功能（神经营养因子、神经生长因子），抗肿瘤活性（CSF诱导物、肿瘤细胞分化诱导物、肿瘤细胞凋亡诱导物）微生物药物•微生物药物的生物合成•抗生素•其他生理活性物质•研究热点与展望微生物药物的生物合成途径•前体聚合•修饰反应•各单位的组装微生物药物生物合成途径的非基因改变•通过底物的代谢调节•添加外源酶抑制剂•发酵条件的改变手段•信号调节•生长速率调节•营养代谢调节•反馈调节•诱导调节•细胞膜通透性调节•金属离子调节•热休克反应微生物药物生物合成途径的基因改变•突变生物合成•原生质体融合•基因操作–限速酶的基因操作–调节基因的操作–转座子的操作–自主复制质粒的导入组合生物合成•组合生物合成（combinatorialbiosynthesis）是指结构不同但生物合成途径相似的次级代谢产物合成基因之间可以进行重组、组合或互补产生新结构的化合物。•基本原理组合生物合成首先是建立在天然产物生物合成的基础之上的。天然产物的生物合成是由一系列酶系作为介导，由低级代谢物起始，经过一系列反应最终合成终产物。组合生物合成的目的是在了解每个酶系在天然合成过程中作用的基础上，重新组合以创制新结构的化合物，这种新组合的可能性是建立在次级代谢合成酶对底物的宽容性及特异性之上的。•组合生物合成的基因操作–PKSI型基因组合操作–PKSII型基因组合操作•组合生物合成的表达系统•组合生物合成的各类型化合物–聚酮类化合物–非核糖体多肽合成酶类介导合成的化合物–由核糖体机制介导的多肽类化合物–氨基糖苷类化合物•问题及展望问题•单元间蛋白的相互作用及酶动力学的问题•不同物种间基因调控机制的问题•合成后修饰的问题•生物学与化学的有机结合问题•可进行基因转化的系统过少•体外蛋白系统的研究•基因资源的广泛开发生物转化•组合生物催化（转化）（combinatorialbiocatalysis），就是利用一种或几种微生物的一种或几种酶的专一催化功能，对用作底物的某个有机化合物的分子结构的特定位置，实现一种或几种化学反应的操作，使其转化成结构相似的更有价值的新化合物。•所谓的组合生物催化，为一种利用酶或微生物作为催化剂，通过对先导化合物（leadcompounds）反复的生物转化以建立化合物库的技术或方法。微生物转化的特点•可减少化学合成步骤，简化生产设备，缩短生产周期。如黄体酮合成可的松需要30多步，而用微生物转化法，只需7步；生产炔诺酮，微生物法转化可减少6步工序。•可提高产物得率和质量、降低成本。•可进行化学法很难进行的反应。如甾体化合物C11上加氧（羟化）等反应，化学法很难进行，而采用微生物法则比较容易。•可改善生产操作条件，避免或减少使用有毒物质。•可利用几种微生物联合在不同部位进行反应。生物转化的反应类型•氧化反应–羟基化–醇基氧化–环氧化作用–碳-碳键的裂开–双键的导入反应–过氧化反应–杂原子氧化•还原反应–还原酮到醇–还原醛到醇–还原某氢过氧化物到醇–还原烯醇到伯醇–双键饱和•水解–酯化–醚开裂•异构化–△6-3-酮异构化成△4-3-酮–D高环化–反频哪酮重排–醇差向（立体）异构–5α－8α表二氢化合物重排到桥氧醇结合•结合–羟基乙酰化–糖苷化–酚醚形成–胺的乙酰化–甾体生物碱与碳酸相结合•引入杂原子–氮：由21位醇基甾体形成21－乙酰胺甾体–卤素：卤素氧化酶催化导人宏基因组技术•所谓“宏基因组技术（metagenometechnology）”，就是一种不依赖于微生物的培养，将外源的环境DNA进行分离、克隆和表达的技术。•策略–基于功能的对外源克隆表达的DNA文库进行筛选；–基于对外源基因测序结果的筛选。抗生素•抗生素是包括微生物、动植物在内的生物体，在其生命活动过程中所产生的或由其它方法获得的，能在低微浓度下有选择地抑制或影响其它生物体机能的有机物质。•天然抗生素•半合成抗生素•人工合成抗生素•抗生素的筛选•抗菌肽•耐药性问题类别•β-内酰胺类•氨基糖苷类•大环内酯类•肽类•四环素类•蒽环类•安莎类•杂环类•脂链类•核苷类•其他作用机理•影响细胞壁的合成；•影响细胞膜的功能；•抑制核酸的生物合成；•抑制蛋白质的生物合成；•影响细胞的能量代谢。半合成抗生素•半合成抗生素就是用化学或生物学的方法改变己知抗生素的化学结构，或引入特定的功能基团，从而获得新的抗生素品种或其衍生物的总称。•半合成过程一般分两个阶段进行：第一阶段是通过生物合成法来制取某种抗生素；第二阶段是将已制得的天然抗生素，再通过化学或生物学方法改变其原来的化学结构，或引入功能基团。•增强抗菌活性•扩大抗菌谱•克服耐药性–降低底物对酶的结构适应性–消除钝化酶作用基团–增辟新作用点–增强青霉素结合蛋白（PBP）亲和力的修饰•降低毒副作用•改善药理性质，提高生物有效性•改善药物动力学性能–增强稳定性–改善吸收提高血药浓度–延缓消除半衰期•适应制剂需要的修饰常见的半合成抗生素•半合成青霉素目前用于临床的半合成青霉素有：苯氧乙基青霉素（非奈西林）、羧氨苄青霉素（阿莫西林）、苯氧丙基青霉素（普匹西林）、迭氮青霉素（迭氮西林）、甲氧青霉素（甲氧西林）、氨苄青霉素（氨苄西林）、磺苄青霉素（磺苄西林）、苯咪唑青霉素（阿洛西林）等。•半合成头孢菌素目前临床上使用的头孢茵素基本上都是半合成的，如头孢噻吩，头孢氨苄、头孢咪唑、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克罗、头孢乙腈、头孢匹林等等。•半合成氨基糖苷类抗生素如3’，4’一双脱氧卡那霉素B（DKB），是以卡那霉素B为原料合成的；定胺卡那霉素（BB—K8）、1-N-乙基西素米星等。链霉素经过结构改造和合成3’－去氧双氢链霉素。•半合成四环素类抗生素目前临床使用的半合成四环素类抗生素有：甲烯土霉素、去甲基土霉素、强力霉素、二甲胺四环素、四氢吡咯甲基四环素等。•其它半合成抗生素如半合成利福霉素、半合成林肯霉素、半合成红霉素、半合成博来霉素、半合成两性霉素等等。人工合成抗生素•喹诺酮类药物–喹诺酮类（quinolones）是人工合成的含4－喹诺酮基本结构，对细菌DNA螺旋酶（DNAgyrase）具有选择性抑制作用的抗菌药物。•磺胺类药物–磺胺类药是三十年代发现的能有效防治全身性细菌性感染的第一类化疗药物。在临床上现已大部被抗生素及喹诺酮类药取代，但由于磺胺药有对某些感染性疾病（如流脑、鼠疫）、具有疗效良好，使用方便、性质稳定、价格低廉等优点，故在抗感染的药物中仍占一定地位。磺胺类药与磺胺增效剂甲氧苄啶合用，使疗效明显增强，抗菌范围增大。喹诺酮类药物•抗菌作用机制：氟喹诺酮类通过抑制DNA旋转酶，阻碍DNA复制而抗菌。氟喹诺酮类药并不是直接与DNA螺旋酶结合，而是与DNA双链中非配对碱基结合，抑制DNA螺旋酶的A亚单位，使DNA超螺旋结构不能封口，这样DNA单链暴露，导致mRNA与蛋白合成失控，最后细菌死亡。•喹诺酮类药物–第一代：萘啶酸（nalidixicacid）是应用于临床的第一个喹诺酮类药（实是萘啶酮）–第二代：吡哌酸（pipemidicacid）抗菌活性强于萘啶酸，口服少量吸收，不良反应较萘啶酸少。–第三代：诺氟沙星（norfloxacin），随后合成一系列含氟的新喹诺酮类药，通称为氟喹诺酮类（fluoroquinolones）•氟喹诺酮类药理学共同特性–抗菌谱广；–细菌对本类药与其他抗菌药物间无交叉耐药性；–口服吸收良好，部分品种可静脉给药；–适用于敏感病原菌所致的呼吸道感染、尿路感染、前列腺炎，淋病及革兰阴性杆菌所致各种感染，骨、关节、皮肤软组织感染；–不良反应少（5％～10％），大多轻微。•常用药物–诺氟沙星（norfloxacin）：用于泌尿系和肠道感染；–环丙沙星（ciprofloxacin）：应用广，抗菌活性强用于G—、耐茵菌株感染；–氧氟沙星（ofloxacin）：用于全身感染–洛美沙星（lomefloxacin）和氟罗沙星（fleroxacin）：抗菌谱广，抗菌活性强口服吸收好；–司氟沙星（sparfloxacin）：主要对G—、G＋用于耐药菌株感染磺胺类药物•药理学特点–抗菌谱广；–细菌对各种磺胺药间有交叉耐药性；–磺胺药中有可供局部应用