搜索
复制起始模型建立复制起始的概念病毒原核生物：大肠杆菌真核生物复制起始在细胞周期的调控DNA复制的引发复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一富含AT的部位叫做复制起始点(originofreplication)常用ori或O表示。DNA复制起始☆原核生物染色体、病毒和核外DNA通常只有一个复制起点。☆真核生物染色体有多个复制起点，彼此相隔约3-10万bp。DNA复制起始至少需以下三个步骤:起始蛋白识别一个或一个以上的顺式作用元件DNA双链局部解旋选择适宜位点进行引物合成及开始聚合反应一、病毒SV40的复制起始1、T抗原与起始核心序列特异结合2、Pola-primase复合物的亚单位在RP-A存在及ATP水解条件下,T抗原具有解旋酶活性使DNA出现更大范围解链.起始效率与DNA构象变化成正相关。Pola-primase复合物含四个亚位:p180、p86、p58、p48二、原核生物的复制起始大肠杆菌的复制起点为oriC，由245个碱基对组成，这些序列在多数细菌中高度保守，关键序列是3个13bp和4个bpd的重复序列参与复制起始的9个蛋白和酶蛋白质亚基数目功能DnaA1识别起点序列，在起点特异性位置解开双链DnaB6解开DNA双链DnaC6帮助DnaB结合于起点HU2类组蛋白，DNA结合蛋白，促进起始引物合成酶（DnaG）1合成RNA引物单链结合蛋白（SSB）4结合DNA单链RNA聚合酶5促进DnaA活性DNA旋转酶（拓扑酶Ⅱ）4释放DNA解链过程中产生的曲张力Dam甲基化酶1使起点GATC序列的腺嘌呤甲基化复制起始的过程因为DNA聚合酶只能延长而不能开始新链合成，所以DnaB蛋白活化引物合成酶，先合成一小段以RNA为起始的引物（10-15bp），并最终被切除并由DNA取代。复制时，在原点通过解旋、解链和SSB蛋白结合等过程，这个复制点因形状象叉子，称复制叉。三、真核细胞的DNA复制起始复制器的选择：G1期A区主要由11bp的ARS共有序列(ACS)—5’(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)3’组成,为复制起始所必需.B区由2一3个部分重复的亚区(B1,B2等)组成，位于A区3’端,不具遗传保守性.复制起始位点的激活：S期起始识别复合物(ORC)以ATP依赖的方式特异识别ACS区和B1区并与之结合.复制器的选择（G1）ORC识别并结合复制器募集解旋酶装载器（Cdc6和Cdt1）ORC和装载器募集解旋酶（Mcm2-7复合体）最终形成前复制复合体（pre-RC)复制起始位点的激活（S）Cdk和Dbf4磷酸化pre-RC，促使DNA解旋DNA聚合酶和辅助因子与复制起始位点的结合，并合成RNA引物装载滑动夹，聚合酶切换，开始合成前导链后随链模板足够长时启动后随链的合成酿酒酵母的起始识别复合物(ORC)是一种复杂的蛋白质由六种不同的亚基-orc1，orc2，orc3，orc4，orc5，orc6构成。ORC1和ORC5亚基含有ATP结合结构域，可与ATP结合，但只有ORC1水解ATPOrc125这五个亚基与DNA接触并负责结合A区，Orc6一直不与DNA接触ScORC与起始位点结合贯穿整个细胞周期起始识别复合物在酿酒酵母中最早确定裂殖酵母的复制起始是完全不同于酿酒酵母裂殖酵母的复制起始有一个大小为500–1500bp的序列，是酿酒酵母的5–10倍。裂殖酵母起始区缺乏一个明显的共识序列，但它们包含两个或更多的重要序列，些非常重要的富含A-T的序列经常是不对称的，A在一条链，T在另一条链，这是ars3001，ars3002，和ars2004起始区基因缺失造成的。裂殖酵母的起始区也有ARS活动，使含一个起始区的质粒可在其中保持稳定并复制。裂殖酵母中有500–1000强弱不一的复制起始点，分布在三条染色体上。裂殖酵母ORC（sporc）有一个额外的域位于其N-末端的orc4亚基中部，这一区域包含9个AT钩，用于结合非对称的AT序列。每一个裂殖酵母有两个或两个以上的ORC结合位点，sporc不与它的同源起始区随机结合。9个sporc4的AT钩将sporc完全绑定到那些非常重要的AT丰富而不对称的DNA序列。sporc和DNA之间的相互作用不需要ATP除了基本的ORC结合位点，裂殖酵母的起始区包含另一种重要位点，是SAP1蛋白结合位点。SAP1最初被确定为是一个蛋白被绑定到一个序列的交配型开关，在复制叉稳定性方面发挥重要的作用。SAP1结合在裂殖酵母ars3001一个重要区域，绑定到一个序列（A/T）4þN（C/g）（A/T）10–11（C/G）（A/T）4þN。像ORC一样，在起始区可能有多个亲和力不同的SAP1结合位点。复制起始在细胞周期的调控DNA复制起始在细胞周期中存在两个调控点M/G1过渡时建立复制前染色质状态G1/S过渡时参与复制起始的蛋白质因子接受周期依赖的调节,直接引发DNA合成.(复制起始复合体组装)复制前染色质状态相关因子：微小染色体维持基因家族MCM和CDC6、周期蛋白及其依赖的激酶。酵母体系中,M-S期核内的MCM5/CDC46作用于复制起始点,与ORC、ARS相互作用.CDC6的表达在M/G,期达到高峰,它在细胞周期的早期与ORC相互作用,提高起始点活性.哺乳类细胞中,在整个间期MCM基因产物都存在于核内,但它的G1期磷酸化水平与G2期明显不同.MCM突变株ARS活性降低,复制难以起始.在芽殖酵母中，ORC作为加载垫将Cdc6聚集在G1期的早期。然后，ORC和CDC6一起激活CDT1–MCM形成前复制复合体。MCM加载出现重复，意味着每个起始点都装上了几个MCM分子，作为复制叉出现损伤或障碍时的备份，以顺利完成复制。MCM加载到DNA不再需要ORC和CDC6辅助的辅助。在裂殖酵母，前复制复合体也需要ORC，Cdc18、CDT1、MCM和一个必不可少的额外蛋白SAP1。ORC和SAP1共同作用才能激活CDT1SAP1是一个新发现的复制起始蛋白直接参与前复制复合物组装，参与pre-RCs对Cdc18的加载。Cdt1和Cdc18加载到起始区后，这两种蛋白质共同负载MCM，与起始区结合完成前复制复合物的组装。CDKs可防止重复复制：协调复制和细胞周期.1、防止复制蛋白在G2期与复制起始点结合；2、CDK活性增高使细胞进人S期：S期的高浓度CDK将抑制蛋白因子在起始点的继续组装.这样,当在M/G1期组装于起始点的起始复合物经复制被破坏后,细胞在S、G2期不能重新组装起始复合物.因而从M期到Gl期限制点这段时期内,由于原有周期蛋白降解,新的周期蛋白还未合成,CDKS活性较低有利于复制前状态的建立和维持.周期蛋白及其依赖的激酶CDK的调解作用DNA复制起始的引发酵母体系在生长因子等刺激下,G1期周期蛋白1、2和3活跃表达和积累，使细胞得以通过起始点（START）.起始点与S期间有两点联系:1、B型周期蛋白5和6依赖起始点的表达.它们可与周期蛋白依赖的激酶CDC28,CDK抑制因子P40形成复合物.2、该复合物被依赖起始点的P40降解激活.CDC28可使RP-A、CDC7等磷酸化.CDC7活化后在晚G1期磷酸化，调节ORC、MCM或其他蛋白质,激活DNA复制哺乳动物细胞内不止一种CDC(CDK)和周期蛋白参与这一过程G0期哺乳类细胞受生长因子刺激后,周期蛋白D出现早于周期蛋白E.周期蛋白D和它的mRNA不稳定.去除生长因子后,水平迅速下降.周期蛋白D可与CDK2、CDK4、CDK5结合,在细胞周期内发挥双向调节作用:a.刺激Gl期进行.b.确保DNA不提前复制.周期蛋白E的水平在G1/s过渡期最高.周期蛋白E可以结合并磷酸化修饰CDK2,作用于复制起始因子,诱导细胞进入S期.期蛋白E-CDKZ可使视网膜母细胞瘤敏感蛋白P150-Rb磷酸化,这是G1向S过渡的关键步骤.周期蛋白A的合成开始于Gl/S过渡期并迅速进入胞核.周期蛋白A-CDKZ可磷酸化调节核蛋白P1,RP-A,组蛋白,Polα等多种参与DNA复制起始的因子，P1和RP-A起共同的“登记”作用。