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DNA提取原则1、应保证核酸一级结构的完整性；2、排除其它分子的污染3、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。一、标本的要求和保存血液EDTA做抗凝剂，不可用肝素RNA尽快提取或者-20℃保存DNA4℃短期保存组织新鲜组织液氮罐保存（-80℃）石蜡玻片和包埋组织应没有H.E染色室温保存核酸提取的一般过程I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中破碎细胞提取纯化1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）①机械方法：研磨法、匀浆法；②物理法；反复冻融，总热骤冷法、超声波法③化学及生物法，自溶法用SDS处理细胞、渗透法蛋白酶K法、溶菌酶2）DNA的纯化根据核酸的性质和特点除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。硅质材料高盐低PH值结合膜，低盐高PH值洗脱。快速高效。沉淀法2倍体积的无水乙醇或者0.6倍体积的异丙醇。阴离子交换树脂低盐高PH值结合核酸，高盐低PH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。DNA的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃保存最佳和最简单（短期保存）-20℃保存（长期保存）保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0一、基因组DNA-CTAB法（1）CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液（Nacl＞0.7mol/L）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。二、基因组DNA-SDS法（1）原理SDS是一种阴离子蛋白质变性剂，在高温(55-65℃）条件下能裂解细胞．细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。提高盐(KAc或NH4Ac）浓度并降低温度(冰浴)，使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀。上清液用酚/氯仿反复抽提除去蛋白质，再用乙醇沉淀水相中的DNA。然后用RNase酶除去RNA即可得到较纯的DNA.三、实验室提取DNA的经典方法酚-氯仿法提取DNA蛋白酶K破损细胞酚、氯仿作为蛋白质的变性剂无水乙醇纯化DNADNA酚－氯仿法提取的模板质量最好，保存时间也长，但操作步骤繁杂，成本也高，而且酚和氯仿均有挥发毒性，对环境造成诸多危害，长期使用严重危害人体健康。结果分析浓度纯度的测定紫外分光仪OD280蛋白质的最大紫外吸光度OD260DNA的最大紫外吸光度DNA纯度范围1.7OD260/OD2801.9DNA提取中常见问题及解决方案问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子对策1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）问题二：DNA降解原因1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融对策1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题三：DNA提取量少原因1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失对策1.尽量选用新鲜的材料2.匀浆研磨充分3.高温裂解时，时间适当延长4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒