第八讲 端粒和端粒酶

第八讲端粒与端粒酶沈晗线性DNA复制过程中会出现一个问题，复制结束时，随从链的5’末端的RNA引物会被细胞中的RNA酶所降解，因为缺乏3’-OH，缺口不能被补上，所以每复制一轮，RNA引物降解后新生成的5’末端都将缩短一个RNA引物的长度，尽管这个引物不长，但是细胞千千万万代地不断复制，如果不进行补偿，染色体不断缩短，最终就会消失！1972年，JamesWatson首先提出了染色体复制的末端隐缩问题一、端粒概念的提出1939年，BarbaraMcClintock（因为发现玉米的转座子获得诺贝尔奖）发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合，而正常染色体的自然末端，为什么不容易相互融合呢？合理的推测是，染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末端，它应该有一个特殊的结构来避免染色体之间的相互融合。在逐渐明晰了染色体末端特殊结构的概念之后，人们给了它一个专有名称-端粒（telomere）。二、端粒的基本性质三、端粒的基本功能四、端粒的研究历史2009年10月5日，伊丽莎白・布莱克本、卡萝尔・格雷德和杰克・绍斯塔克三位美国科学家一起获得了今年的诺贝尔生理学或医学奖。关于他们获奖的原因，颁奖词中这样描述：“他们解决了生物学的一个重大问题：在细胞分裂时，染色体如何完整地自我复制以及染色体如何受到保护以免于退化。这三位诺贝尔奖获得者已经向我们展示，解决办法存在于染色体末端――端粒，以及形成端粒的酶――端粒酶。”这是百年来诺贝尔奖第一次同时颁发给两位女性科学家，他们3人将分享1000万瑞典克朗（约合966．7万元人民币）奖金。三位获奖科学家3位获奖者中，布莱克本最具名望，2007年曾入选《时代》百大最具影响力人物。其余两位得主都是自她的研究得到启发，并与她合作取得成果。除了科研了得，她的敢言作风亦为人称道，她曾获美国前总统小布什委任入生物伦理委员会，但她在布什禁止干细胞研究后，公开批评他以意识形态干预科学研究，2004年被辞退。布莱克本出生于澳大利亚，来自一个医生世家，家人期望她从医，但她却决意要走科研之路。1971年，她在英国剑桥大学攻读博士学位，师从诺贝尔得主桑格（FredSanger）。1975年获得博士学位后，她转到耶鲁大学，开始研究端粒。1978年在加利福尼亚大学伯克利分校建立实验室，经过不懈努力，终取得重大发现。布莱克本发现端粒序列所用到的简单模式生物四膜虫四膜虫的小染色体众多，也就说端粒可能非常丰富。这就为端粒研究提供了得天独厚的材料。1978年，布莱克本通过体外合成参入dNTP的实验，利用四膜虫的染色体发现端粒的秘密。推断四膜虫的端粒是由许多重复的5‘-CCCCAA-3’六个碱基序列组成的。1980年，在一次科学会议上，布莱克本为这个看似无趣的秘密找到了用武之地。这要感谢听她报告的绍斯塔克。当时绍斯塔克正打算给酵母细胞人工合成一条DNA。但是，光秃秃DNA的容易给酵母细胞中的核酸酶吃掉。布莱克本和绍斯塔克一拍即合，决定给DNA片段末端加上这些CCCCAA碱基序列结果让人大吃一惊——人工DNA能够稳定的存在于酵母细胞内。1984年，布莱克本的实验室发现酵母的端粒序列是由不太规则的TG1-3/C1-3A重复序列组成的。形象地说，线性DNA就像一条鞋带，端粒就像两头的塑胶套，没有塑胶套的保护，鞋带很容易劈叉，磨损，直至散架1984年，格雷德作为博士生加盟了布莱克本的实验室。在捣碎无数的四膜虫之后，他们终于成功的分离了端粒酶。这个端粒酶的名字有点与众不同。我们一般在给酶命名时，都以它的作用对象命名。比如，分解淀粉的叫做淀粉酶，分解蛋白质的叫做蛋白酶。而端粒酶刚好相反，它是以产物命名。更有意思的是，它合成端粒的DNA片断是自带的。也就是说，端粒酶相当于一个小作坊，自己为合成端粒DNA提供复制所需的原材料，完成添加端粒所需的重任。端粒和端粒酶发现大事记1939年，BarbaraMcClintock发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合1972年，JamesWatson提出染色体复制的末端隐缩问题1978年，报道四膜虫的端粒序列1982年，端粒的发现导致人工染色体的发明1984年，报道酵母的端粒序列1985年，报道四膜虫的端粒酶活性1989年，报道四膜虫端粒酶的RNA亚基1994年，报道酵母端粒酶的RNA亚基1995年，报道酵母端粒酶活性1996年，纯化了四膜虫端粒酶的催化亚基,遗传筛选到酵母端粒酶的催化亚基1997年，证明了四膜虫和酵母端粒酶的催化亚基端粒和端粒酶的一系列发现完美地解释了这两个问题：染色体末端的DNA由简单重复的端粒序列构成，端粒（保护着染色体末端，使之区别于一般的断裂染色体末端，而不被各种酶降解，相互之间不会融合。端粒酶负责端粒的复制，端粒酶的催化亚基利用端粒酶自己的RNA亚基作为模板通过转位不断重复复制出端粒DNA，从而补偿在染色体复制过程中的末端隐缩，保证染色体的完全复制五、端粒及端粒酶的结构特点（一）端粒的结构及组成端粒：是真核细胞线性染色体末端特殊结构。由端粒DNA和端粒相关蛋白组成。端粒DNA：为不含功能基因的简单、高度重复序列,在生物进化过程中具有高度保守性。不同物种的端粒DNA序列存在差异。端粒DNA由两条互相配对的DNA单链组成,其双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和TRF2结合共同组成t环(tloops)。这种t环特殊结构可维持染色体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性,从而使遗传物质得以完整复制。电镜下的端粒T环结构大多数有机体的端粒DNA由非常短而且数目精确的串联重复DNA排列而成，富含鸟嘌呤，人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5′TTAGGG3′的重复序列,长约15kb。体细胞的端粒有限长度大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，直至细胞衰老。人类体细胞遵循这个规则从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细胞亦如此。荧光原位杂交显示端粒和端粒DNA序列端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(富含G链)3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(富含C链)（二）端粒酶的结构端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（TERT）端粒酶结合蛋白（TEP）端粒酶示意图端粒酶活性取决于它的RNA和蛋白质亚基.端粒酶至少包含两个活性位点.端粒酶除了具有反转录活性外，还具有核酸内切酶的活性。另外一个重要的功能就是合成串联重复的TTAGGG序列，为TRF2提供结合位点，防止染色体的末端融合。端粒酶的RNA亚基是合成端粒DNA的模板，对于端粒酶的结构和催化活性都十分重要.人端粒酶RNA有455个核苷酸.端粒酶RNA重要序列缺乏保守性，但都有保守的二级结构，端粒酶的RNA决定了端粒DNA的序列。1、端粒酶RNA哺乳动物端粒酶RNAs在许多组织的不同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。体内端粒酶RNA的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶RNA的稳定性与突变,也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡。2、端粒酶逆转录酶(Telomerasereversetranscriptase,TERT)几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT基因,哺乳动物TERT的转录由许多转录因子、激素和细胞外信号严格控制。不同的转录因子调节hTERT在不同的细胞内含物中的表达。癌基因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因,并可与H－Ras、N－Ras、多瘤病毒MT、LT等癌基因协同作用,促进细胞无限增殖,获得永生化并发生癌变。3、端粒酶相关蛋白(TEP)⑴端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA结合蛋白，对端粒酶活性起调节作用⑵生存动力神经细胞基因(SMN)产物热休克蛋白（hsp）90、其他涉及到TERT转录后修饰的蛋白包括磷酸酶-A、Akt、cAbl、p53和PARP。PinX1与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。⑶芽殖酵母蛋白Est1p和Est3p这两个蛋白与体内端粒酶的功能有关。Est1p足以使端粒延长。但是,在无Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端粒长度。2008年美国科学家利用X射线结晶学方法，揭示了端粒酶（Telomerase）关键部位的三维结构图端粒酶结构示意图。蛋白质（绿色）与RNA（浅褐色）及DNA（紫色）联合在一起。四膜虫端粒酶对端粒DNA的复制模式图端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的功能端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。端粒酶以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。在体内还不清楚每一次细胞分裂有多少端粒DNA合成。体内端粒酶的延长功能是一复杂的动态过程:受双链端粒结合蛋白包括RAP1(芽殖酵母)、存在于t环的TRF1(依赖于端粒酶)和TRF2(不依赖于端粒酶)的负调控。六、端粒－端粒酶对与肿瘤的发生“端粒－端粒酶假说”认为端粒酶的激活与细胞永生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的端粒DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。相对地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被认为是细胞永生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实,端粒酶对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。端粒酶被抑制正常人体细胞端粒丢失M1期阻滞SV40T抗原细胞分裂停止Rb、P53与病毒蛋白结合、突变↓M1—M2期间隔永生化双着丝粒形成↓M2期退化染色体失稳端粒酶被激活细胞凋亡端粒酶在人体细胞永生性转化中端粒变化与肿瘤发生尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematireLengtheningoftelomereALT）机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国学者在400多例来源于12种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8％，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4％。附表人体组织中端粒酶活性肿瘤部位/类型与肿瘤邻近正常组织/良性病变肿瘤组织（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）结肠0/45（0）22/23（95.6%）肝——1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）肾0/55（0）40/55（72.7%）神经母细胞瘤0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLLALL）——21/23（91.3%）脑——6/8（75%）其它（头顶部，Wilms瘤）8/93（8.6%）24/26(92.3)合计14/332（4.2%）365/430(84.8)85%～90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。一般认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持,避