遗传病的治疗-华北煤炭医学院精品课程网

第十三章遗传病的治疗本章节重点药物治疗和饮食控制疗法的原则基因治疗的概念目的基因转移的方法基因治疗的应用遗传病的治疗常规治疗包括：手术治疗、饮食、药物控制和物理疗法。近十年随着人们对遗传病发病机制的逐渐深入及分子生物学技术在医学中的广泛应用，使遗传病的治疗从常规治疗跨入了基因治疗，为根治遗传病带来了希望。第一节手术治疗–手术矫正畸形–改善症状（切脾：遗传性溶血病）–器官和组织移植：重型地中海贫血、遗传性角膜萎缩、a1抗胰蛋白酶缺乏）第二节药物治疗原则：补其所缺去其所余可分为：出生前治疗、症状前治疗和现症病人治疗。一、出生前治疗是指经产前诊断后给孕妇服药，通过胎盘达到治疗胎儿的目的。如：羊水中甲基丙二酸含量增高，胎儿可能患甲基丙二酸症，会引起新生儿发育迟缓和酸中毒，应在出生前和出生后给母体和患儿注射大量VB12。羊水中T3增高，胎儿可能患甲状腺功能低下，给孕妇服用甲状腺素。二、症状前治疗先天性甲状腺功能低下是一种甲状腺形成或甲状腺激素的合成缺陷性疾病。患儿甲状腺功能低下，应给予甲状腺素终生服用，以防患儿智能和体格发育障碍。三、现症病人治疗（一）、激素替代疗法垂体性侏儒症患者给以生长激素（二）、补其所缺生化遗传病的补缺：蛋白、酶或反应终产物（三）、去其所余–促排泄剂：消胆胺–代谢抑制剂：别嘌呤醇–螯合剂：D-青霉胺–平衡清除法：溶酶体储积症–换血或血浆过滤第三节饮食疗法原则：禁其所忌一、产前治疗二、现症病人治疗第四节基因治疗基因治疗（genetheraphy）：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。1、直接疗法：纠正突变基因（基因修正）也就是在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。这种方法上较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）2、间接疗法：以正常基因替代致病基因（基因添加）非定点导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。二者均是用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。途径就基因转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗2、体细胞基因治疗1、生殖细胞基因治疗理论上将正常基因转移到患者的生殖细胞（精细胞，卵细胞或早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。但还存在某些问题：1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）2．体细胞基因治疗（somaticcellgenetherapy）是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。使患者症状消失或得到缓解，但有害基因仍能传给后代。基因治疗关键：①外源基因的安全导入；②外源基因高效正确的表达。基因治疗条件：①疾病的发病机制及相应基因的结构功能清楚②已克隆正常基因，且明确该基因表达与调控机制③导入基因具有合适的受体细胞，并能有效表达④具有安全有效的转运载体和方法基因治疗的步骤：1．正常基因的制备：即分离、提取外源基因（目的基因）2、靶细胞的选择3、外源基因（目的基因）的转移4、表达的检测5、回收到患者体内。二、基因治疗的方法（Themethodsofgenetherapy实施基因治疗的第一个关键性步骤是基因转移（一）、目的Gene转移方法通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。1.物理方法①直接注射法利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核中。②电穿孔法（electroporotion）将细胞至于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。瞬间细胞细胞膜核膜通透性增加高压脉冲DNA渗入细胞③微粒子轰击法2.化学法：磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简单，但转化效率低。Ca2(PO4)2+DNA→混合微细颗粒（Ca离子浓度125mmol，DNA离子浓度5～0ug/ml。PH7.0）↓沉淀反应20~30min↓细胞在沉淀物中暴露5~24h3.膜融合法脂质体法（liposome）应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构—脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。DNA脂膜DNAPEG仙苔病毒胞融合转化细胞4.受体载体转移法:重组质粒+特异性多肽→内吞5.同源重组法(homologousrecombination)将外源性目的基因定位导入受体细胞的染色体上，通过与该座位的同源序列重组交换，使外源DNA取代原位点上有缺陷的基因，达到基因修正的目的。XbaIXbaIBstI11.1KbXbaIBstIneo13.1KbBstIneoXbaIBstIXbaIBstIXbaI16.5Kb7.7Kb通过同源重组定点插入珠蛋白基因重组后，插入外源基因外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo的培养基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。带有珠蛋白基因的质粒正常基因座位6.病毒介导转移法以病毒为载体，将外源性目的基因通过基因重组技术，组装到病毒载体上，并使重组病毒感染受体宿主细胞，完成基因转移。感染细胞逆转录病毒(RNA)常用的病毒载体DNA病毒1)逆转录病毒（retrovirus）目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。逆转录病毒的生活史将病毒RNA包装成病毒颗粒逆转录病毒结合细胞表面将RNA注入细胞质逆转录合成前病毒整合到靶细胞染色体上合成病毒RNA合成病毒蛋白质病毒外壳蛋白质以出芽的方式从宿主细胞中分泌出来逆转录病毒载体优点：①能高效转染宿主细胞，转染率可达100％②宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留③可转染大量细胞并长期停留，病毒基因和所载的外源基因都能表达逆转录病毒载体缺点①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；②病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达；③逆转录病毒有致病作用，可能使受体细胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和ψ包装信号。⑴逆转录病毒载体的构建(缺陷型病毒)5’LTRLTR3’U3RU5U3RU5ψ小鼠白血病病毒(Mo-MLV)gagpolenv病毒核心逆转录酶外壳蛋白抗原基因基因基因5’LTRLTR3’U3RU5U3RU5ψ小鼠白血病病毒(Mo-MLV)外源目的基因ψ－辅助病毒包装细胞RNA包装蛋白病毒颗粒ψ＋RNA重组病毒颗粒⑵逆转录病毒载体的包装含目的基因的重组载体2)腺病毒(adenovirus)优点：①插入DNA片段较长②宿主范围广，不需要正在分裂的细胞③不整合，减少插入突变的潜在危险缺点：①需反复给药②具有免疫原性E1E3bDNAE3a表达E1蛋白的293细胞2).腺病毒(adenovirus)2).腺病毒(adenovirus)表达E1蛋白的293细胞E3abDNA复制缺陷型腺病毒进行基因治疗的优点：①可感染分裂和非分裂细胞②病毒颗粒稳定，易于浓缩和纯化③可导入多种靶细胞，并持续表达④无致癌性（二）、靶细胞的选择可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。选择的原则：①方便从体内取出，且方便植回体内。②在体外能用常规方法大量繁殖。③现有的基因转移技术能高效地将外源基因植入。④植入体内后，能高效持久的表达外源基因。某些代表性细胞外周血T淋巴细胞、皮肤成纤维细胞较符合上述要求。此外，造血干细胞——β地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗。肝C——家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的基因治疗。（三）、反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotides）技术应用DNA和RNA的碱基互补可形成同源或异源双链的原理，人工合成反义RNA(或DNA)，和mRNA互补，使其灭活，阻止其翻译成蛋白质，达到治疗疾病的目的。用反义DNA已对某些癌症进行临床试验。反义基因治疗DNADNARNARNA反义RNA阻断表达目前采用的技术：反义RNA表达载体反义RNA/DNA体外微注射质脂体运载反义RNA；其他方法Cacl2沉淀方法，细胞打孔仪，逆转录病毒导入方法。（四）、“自杀基因”(suicidegene)疗法原理：将编码某种酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，然后用药物来杀死肿瘤细胞。如：自杀基因+病毒载体转染重组载体药物前体无毒Gene→酶→↓药物复合物有毒细胞死亡例如：单纯疱疹病毒哺乳动物细胞HSVGene-TK（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）Gene—TKGCV（胸苷类似物）TdRPpGCV---p抑制DNA合成脱氧胸苷酸肿瘤细胞死亡邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）旁观者效应(by-standereffect)：将一定量转染自杀基因的肿瘤细胞和未被转染的肿瘤细胞一起培养，转染自杀基因的肿瘤细胞被药物杀死时，未被转染的肿瘤细胞也会被杀死。（五）多抗药性基因疗法多抗药性(MDR)基因(六）抑癌基因疗法野生型抑癌基因的失活和肿瘤的发生密切相关，将野生型抑癌基因导入肿瘤细胞，替代和补偿有缺陷的抑癌基因，以抑制肿瘤的生长或逆转其表型，称为“基因替代疗法”。基因治疗实例1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）。ADA缺乏症-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。AshantideSilva.Now17,Ashantiwasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapy.ShereceivedinfusionsofTcellsthathadbeentransducedwithageneforADA(anenzymethatshelacks)治疗基本步骤:ADA基因+逆转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能,改善病人症状ADA-Gene+vector（逆转录病毒）重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂10天Gene表达回输患儿体内1~2月治疗一次10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%2.乙型血友病1991年复旦大学首次进行乙型血友病的基因治疗，利用逆转录病毒转移Ⅸ因子的cDNA到体外培养的患者皮肤成纤维细胞中，再回植入患者皮下。患者体内可检测Ⅸ因子的基因表达产物，浓度约为正常人的5％。3.肿瘤的基因治疗①细胞因子用于肿瘤基因治疗1984～1987年，淋巴激活的杀伤细胞(LAK)1986年，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)结合IL-21991年，肿瘤坏死因子(TNF)治疗黑色素瘤例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗①IL-2Gene②TNF-Gene（白介2）（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体导入TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞的作用。②“自杀基因”用于肿瘤基因治疗1992年，HSV-TK和GCV四、基因治疗中存在的问题及解决方法1.导入基因的持续表达2.导入基因的高效表达3.安全性问题——Gelsinger事件1999年9月，Arizona的JesseGelsinger因患鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)部分缺乏症在Pennsylvania大学接受基因治疗