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专题2微生物的培养与应用课题1微生物的实验室培养培养基可以分为哪几类？培养基一般都含有哪些营养物质，此外还要满足哪些要求？获得纯净培养物的关键是什么？什么是消毒、灭菌，常用方法有哪些？制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法步骤？学习目标如何倒平板？微生物的类群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌如草履虫、单细胞藻类等无细胞结构真核细胞细菌、蓝藻原核细胞？一、培养基1.概念：人们按照微生物对_________的不同需求，配置出供其____________的营养基质。营养物质生长繁殖2.培养基的类型和用途按物理性质固体培养基:加琼脂；用于分离、鉴定、计数液体培养基：不加凝固剂；用于工业生产。半固体培养基：加少量琼脂；可用于保藏菌种。按化学成分合成培养基：成分明确；分类鉴定。天然培养基：成分不明确；用于工业生产。按目的用途分鉴别培养基：培养基中加入某种试剂或化学药品，区别出不同类型的微生物。选择培养基：根据某一种或一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性设计培养基。如用青霉素选出酵母菌等。选择培养基选择培养基应用加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐分离金黄色葡萄球菌不加氮源分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物加入青霉素等抗生素分离导入了目的基因的受体细胞在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其它种类微生物生长的培养基。鉴别培养基根据微生物的代谢特点在培养基加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同的微生物只起鉴别作用，并不能抑制其他微生物固体培养基液体培养基培养基一般都含有哪些营养物质，此外还要满足哪些要求？不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐等营养物质另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。一.培养基：微生物生存的环境和营养物质1.基本成分：碳源、氮源、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、蛋白胨等自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等注：对于异养微生物，含C、N的化合物既为碳源，也是氮源。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g培养基配制原则⑴目的明确：⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当⑶适宜的pH值：有机碳源异养型：根据微生物的种类、培养目的选择原料自养型：不加碳源加入缓冲剂（CO2碳源）生产科研2.无菌范围：实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒实验用具灭菌实验操作过程二.无菌技术：防止外来杂菌的污染1.消毒与灭菌：酒精灯旁操作超净工作台二、无菌操作技术1.获得纯净培养物的关键？防止外来杂菌入侵2、无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？避免操作者自身被微生物感染消毒与灭菌消毒：使用较温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。灭菌：使用强烈的理化因素杀死物体内所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对恶劣的环境有很强的抵抗力。每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。——特殊的休眠构造消毒的方法：1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线适用对象：操作空间、液体、双手等灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手消毒灭菌灭菌练习：思考并讨论下面的仪器分别用什么样的消毒和灭菌方法？培养基培养皿空气接种环双手牛奶②巴氏消毒③化学消毒⑤紫外线消毒⑥高压蒸气灭菌①灼烧灭菌④干热灭菌单个或少数菌体2.特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。3.功能：1.定义：三、菌落鉴定菌种的重要依据固体培养基上大量繁殖子细胞群体1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g四.大肠杆菌的纯化培养㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：培养基用量依配方计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂→补水定容4.调pH、分装、封口：5.灭菌：6.倒平板：培养基、培养皿倒平板约50℃防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：用手触摸，刚不烫手。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：皿盖凝结水珠，防止水珠落入培养基，造成污染；平板倒置，防止培养基表面的水分挥发。答：最好不用，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。二.大肠杆菌的纯化培养：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌：⑴平板划线法：菌种划3个平板1个不划线1.接种：接种环防止划破培养基（重复实验）（空白对照）问题2：每次划线前灼烧接种环的目的：问题3：划线结束后灼烧接种环的目的：避免接种环上可能存在的微生物污染培养基杀死上次划线结束后残留的菌种及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和操作者。问题1：第一步灼烧接种环的目的：2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。4.为什么不能划破培养基？一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：菌液⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：b.涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照滴灼试涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍⑴平板划线法：二.大肠杆菌的纯化培养：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌：1.接种：⑵稀释涂布平板法：2.培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h～24h后，观察并记录微生物的培养与观察大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征在普通琼脂培养基上：圆形，边缘整齐，表面光滑，半透明。典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为:深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？五、结果分析与评价若有，说明培养基灭菌不彻底相似的菌落，接种符合要求3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。大小会有明显不同无菌操作未达到要求：培养基灭菌不彻底；可能是接种时或培养时污染六.菌种的保藏1.临时保藏：试管固体斜面培养基上4℃2.长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃斜面保藏甘油冷冻管藏法知识小结:【巩固】下列有关平板划线操作的叙述不正确的是()•A．第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物•B．每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种•C．在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液•D．划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者C