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第九章：基因敲除与药学基因敲除技术与诺贝尔奖三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了2007年诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大学的MarieCapecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliversmithies教授以及英国加蒂夫大学的MartinEvans教授基因敲除简介定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。1234567123456790890RNAi同源重组插入突变基因敲除（geneknock-out）通常所说到的基因敲除，又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活。应用DNA同源重组原理进行基因敲除同源重组插入突变RNAi同源重组插入突变发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。1.要有将外援基因导入宿主细胞的载体2.能接受外援基因的受体（常用胚胎干细胞）基因敲除的必备条件基因敲除载体通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导入ES细胞中，一个好的载体应具备以下特点：1.能在宿主细胞中稳定存在2.具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即multiplecloningsite(MCS),便于外源基因的插入。常用质粒。3.具有一个以上的遗传标志，便于对基因重组的ES细胞进行筛选。常用的筛选标记为正负筛选：Neo（新霉素磷酸转移酶）基因阳性筛选标记和HSV-tk（单纯袍子病毒胸腺嘧啶激酶）基因阴性筛选标记。Neo新霉素基因阳性的ES细胞可以再含有G418（一种新霉素的类似物）的培养基上生长。HSV-tk基因阳性的ES细胞，编码的基因产物可以将更昔洛韦等转化为有毒物质，将细胞杀死。胚胎干细胞（简称ES细胞）胚胎干细胞是早期胚胎中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。（1）基因敲除载体的构建Step1.获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此DNA片段克隆到一般质粒中；Step2.从重组质粒中切除目的基因的大部分同源序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；Step3.将neo基因和HSV-tk克隆到质粒中；基因敲除的基本程序根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的不同，基因载体通常分为两种：1．插入性载体(gene-insertionvector)2．置换型载体(gene-replacementvector)大多数的基因敲除中，采用的是置换性载体；而插入性载体则更多的应用于基因敲入和对目的基因的精确突变。（2）基因敲除载体导入ES细胞将基因敲除载体导入ES细胞，以载体上的neo基因置换ES细胞基因组的目的基因，从而得到基因敲除细胞基因敲除载体导入ES的方法有显微注射法，电穿孔法，DEAG葡聚糖介导法，脂质体法，病毒感染法，精子载体法等1.正负双向筛选系统（PNS）：Nero基因表达，ES细胞抗新霉素，在G418的培养基中存活。HSV-tk基因表达，在更昔洛韦的培养基中，ES细胞被杀死。（3）常用的筛选方法有两类2.正向筛选又称标记基因的特异性表达法，仅有正性选择性标记的标记基因，而且这种标记方法是缺乏自身的某个表达调控序列。标记基因因为特异整合，获得调控序列，能够表达。可以分为无启动子筛选法，无增强子筛选法，无poly（A）筛选法。（2）常用的筛选方法有两类3．物理筛选方法主要是PCR筛选方法，优点是灵敏，专一性强；。此外还有富集或筛选率比较高时，可以用Southernblot杂交法，（2）常用的筛选方法有两类（3）基因敲除的ES细胞注射入胚泡（4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中导入动物胚胎后，可以发育成嵌合子或完全ES来源的动物。嵌合体动物与正常的动物杂交，子代动物再杂交，有可能产生杂合型突变体。（5）嵌合体的杂交育种得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。一、条件性基因敲除法：将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。在传统基因敲除的基础上，利用了特异性重组酶系统作为调控的按钮，实现对基因的时刻可调节敲除。与Cre-loxp重组酶系统有关。第三节：基因敲除进展及前景：条件性基因敲除优点：①目标基因的敲除可以限定在特定的组织、细胞或发育的特定阶段；②可避免因基因突变而致死胎的问题：③在2个loxP位点之间的重组率较高；④如用病毒或配体／DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。二、体细胞基因敲除伴随核移植和体细胞克隆技术的发展，体细胞基因敲除-核移植体系为研究热点。选择的体细胞应该有较好的繁殖能力和克隆能力。有时用带端粒酶基因的DNA转染细胞，提高细胞的寿命和活力。三、基因捕获又称随机基因敲除，又称随机基因敲除，是随机插入突变进行基因敲除的一种新型方法。原理：将外源基因（报告基因、标记基因）的载体通过电穿孔或逆转录病毒载体法导入ES细胞，并随机整合到细胞基因组中，建立一个携带随机插入突变的ES细胞库。基因诱捕所用的载体一般由报告基因、选择性标记基因及辅助元件组成。报告基因缺乏自身的某个表达调控序列，在捕获内源基因的相应表达序列后获得表达。根据所诱捕的表达调控序列的不同，广义的基因诱捕包括：增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、poly（A）诱捕。基因诱捕的优点利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。基因诱捕的缺点无法对基因进行精细的遗传修饰，四、RNAi引起的基因敲除①、②：双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，并在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶RNA）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。RNAi引起的基因敲除③：SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物RNAi引起的基因敲除④：上述复合物同与互补的mRNA结合，促进mRNA被RNA酶裂解，并且以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链，并在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。RNAi引起的基因敲除⑤：这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。五、基因敲除的应用1.基因敲除和转基因技术是研究基因的结构功能和其他生命科学理论问题的重要工具。2．建立生物模型。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于报道。3.基因敲除和转基因技术为人类疾病的基因治疗提供有力手段。使用基因工程技术将外源基因导入患者的病变细胞，纠正机体基因缺陷或调节基因表达功能是细胞重新获得正常的功能，这个过程称为基因表达。4.基因敲除和转基因技术通过改造生物体基因，可以用于研制优良的生物反应器，培育新的生物品种和提供异种器官移植的供体动物。随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的，敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样的功能；另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。基因敲除技术的缺陷