DNA和RNA 的分离及显色

实验三DNA和RNA的提取分离及颜色反应一、实验目的学习用稀碱法从酵母中提取DNA和RNA利用不同浓度的NaCl溶液分离DNA和RNA了解核酸的颜色反应二、实验原理酵母经稀碱处理可使酵母细胞壁溶解，核酸释放到溶液，再经过滤，溶于液相中的核酸便与菌体残渣分离，此发的优点是简便快速，溶于液相中的核酸含量较高。缺点是RNA在碱性条件下不稳定，容易分解，因此在稀碱中不宜停留过长时间。利用在不同浓度的NaCl盐溶液中DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度不同的原理可分离DNA和RNA。由于RNA核蛋白易溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而DNA核蛋白难溶于此盐溶液中，这样可通过离心分离使分开。上清液含有RNA，而沉淀中含有DNA，利用戊糖的颜色反应，就可以鉴定出DNA和RNA。显色反应：核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3,5-二羟甲苯反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20~250微克范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚反应特异性较差，凡是戊糖均有此反应。RNA和其他杂质也能给出类似的颜色。二苯胺反应根据对去氧戊糖的特异的显色反应进行DNA定量的方法。其原理是DNA经酸处理，使从嘌呤核苷酸中游离出的去氧核糖在乙醛存在下和二苯胺反应，然后测定反应液的蓝色。由于它不与RNA反应，所以可用来定量测定全核酸中的DNA含量。三、实验材料1、材料干酵母2、仪器台式天平电子天平沸水浴离心机3、器材普通试管20mL×7（干燥）锥形瓶100mL×2量筒50mL×1移液器1mL×32mL×210mL×1滴管×2洗耳球×2滤纸漏斗试管架移液器架试管夹玻棒四、试剂的配置1、NaOH溶液（0.5N）取20gNaOH，用水溶解并定1000mL。2、HCl（1N）取83mL浓盐酸，用水稀释到1000mL。3、苔黑酚试剂将200mg苔黑酚溶于100mL浓盐酸中，再加入100mgFeCl3.6H2O4、二苯胺试剂将1g二苯胺溶于98ml冰醋酸中，再加入2ml浓硫酸（比重1.84）（临用时配置，用前可加几滴乙醛）五、操作步骤1、取材准备称取干酵母2g，置于100mL锥形瓶中。2、碱液浸提加入20mL0.5NNaOH溶液，用玻棒搅碎酵母，置于沸水浴中加热5分钟3、过滤4、分离DNA和RNA。颜色反应123456RNA核蛋白液（ml)0.20.2DNA核蛋白（ml)蒸馏（ml)0.810.81苔黑酚（ml)22二苯胺（ml)22反应在通风橱内，沸水浴5分钟颜色管号操作注意：地衣酚显色法特异性较差，凡是戊糖均有此反应。因此，测RNA含量时可先测定DNA的含量，再计算出RNA的含量思考题1、本实验中分离DNA和RNA方法的原理是什么？2、使用离心机应注意哪些事项？3、地衣酚反应中，干扰RNA测定的因素有哪些？如何能够减少它们的影响？4、提取RNA过程中为什么要严格控制时间、温度、pH值？Thanksforyourpatience!