色谱分析

色谱分析法第一节色谱分析法导论1906年俄国植物学家迈克尔·茨维特(MichaelTswett)从植物提取液中分离出叶绿素及其它色素利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术流动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相一、概念发现定义二、色谱法分类色谱法液相色谱法气相色谱法气-液色谱法气-固色谱法液-固色谱法液-液色谱法（一）按两相状态分类：（二）按固定相的形式分类：柱色谱：固定相装在色谱柱中；纸色谱：利用滤纸作载体，吸附在纸上的水作固定相；薄层色谱：将固体吸附剂铺在玻璃板或塑料板上制成薄层作固定相。（三）按分离原理分类吸附色谱（adsorptionchromatography)分配色谱(partitionchromatography)离子交换色谱(ion-exchangechromatography)凝胶色谱(gelchromatography)亲和色谱(affinitychromatography)其它色谱方法超临界色谱逆流色谱高效毛细管电泳上世纪九十年代快速发展特别适合生物试样分析分离色谱分配色谱离子交换色谱离子色谱凝胶色谱液相色谱薄层色谱超临界色谱高效毛细管电泳气相色谱纸层析薄板层析毛细管气相色谱填充柱气相色谱三、色谱分析的特点(1)分离效率高复杂混合物、有机同系物、异构体、手性异构体。(2)灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。(3)选择性高可将性质相似的组分分开(4)分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析，一次可同时测定多个指标。对未知物分析的定性专属性差需要与其他分析方法联用(GC-MS,LC-MS)不足之处：(5)应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。离子色谱：无机离子及有机酸碱的分离分析填充柱类型气固(液固)色谱气液(液液)色谱固定相多孔性的固体吸附剂颗粒由担体和固定液所组成分离机理固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同固定液对试样中各组分的溶解能力的不同分离过程吸附与脱附的不断重复溶解与挥发的不断重复四、色谱分离过程色谱分离过程是在色谱柱内完成。以填充柱为例五、色谱流出曲线（色谱图）及有关术语（一）气相色谱法分离的过程：以分离A、B两组分为例：024681012024681002468101202468100246810120246810（二）色谱流出曲线--信号随时间的变化曲线1.基线无试样通过时的信号（1）时间表示的保留值保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间调整保留时间（tR＇）：tR＇=tR－tM2.保留值tM（2）用体积表示的保留值保留体积（VR）：VR=tR×F0（F0为色谱柱出口处的载气流量，单位：mL/min。）死体积（VM）：VM=tM×F0调整保留体积（VR＇）：VR＇=VR－VM3、相对保留值r21组分2与组分1调整保留值之比：r21=t’R2/t’R1=V’R2/V’R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。4、区域宽度衡量色谱峰宽度的参数三种表示方法：（1）标准偏差()即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2或W1/2)色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354（3）峰底宽(Wb)Wb=4色谱流出曲线的意义：色谱峰数=样品中单组份的最少个数；色谱保留值——定性依据；色谱峰高或面积——定量依据；色谱保留值或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。第二节色谱分析的理论基础一、分配系数与分配比组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。一定温度下，组分在两相间达到分配平衡时的浓度比称为分配系数，用K表示，即：MsccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。1、分配系数K分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；同一组份在不同固定相上的分配系数K不同；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出；选择适宜的固定相可改善分离效果；气相色谱中柱温对K影响很大，是影响分离效果的一个关键因素MsccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度2.分配比k分配比是指在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：Msmmk组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量分配比也称容量因子或容量比，分配比越大，组分保留时间越长。3.分配比与分配系数的关系式中β为相比，即固定相体积Vs与流动相体积Vm之比值KVVccVVMVVMMMkmSmsmmmSSSmS讨论1.分配系数与分配比都与组分及固定相的热力学性质有关，随柱温、柱压的改变而变化。2.分配系数只决定于两相性质，与两相体积无关，分配比既与两相性质有关，也与两相体积有关。3.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。4.分配比可以由实验测得。二、色谱法基本理论组分要达到完全分离，必须满足两个条件：1两峰间的距离必须足够远：两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。2峰一定要窄：峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为（一)塔板理论塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。1、塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。2、塔板分离过程3、柱效能指标对于一个色谱柱来说，其分离能力（叫柱效能）的大小主要与塔板的数目有关，塔板数越多，分配次数越多，分离效果越好，柱效能越高。色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效塔板数来表示。tR为保留时间；W1/2为半宽度；W为峰底宽度。221/25.54()16()RRttnww（1）理论塔板数n对于一个柱子来说，其理论塔板数可由下式计算：由式可见，柱子的理论塔板数与峰宽和保留时间有关。保留时间越长，峰越窄，理论塔板数就越多，柱效能越高。对于一个柱长固定为L的柱子，其理论塔板高度H为H为每一个塔板的高度，即组分在柱内每达成一次分配平衡所需要的柱长。H越小，n越大，柱效能越高。LHn理论塔板高度H（2）有效塔板数n有效''221/25.54()16()RRttnww同理有效塔板高度为：LHn有效有效塔板理论的意义：(1)当色谱柱长度一定时，塔板高度H越小塔板数n越大，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。(2)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(3)塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。（二）速率理论——范弟姆特方程式速率理论是在塔板理论的基础上，给出了影响塔板高度的因素：BHACuuu为流动相线速度；A，B，C为常数，其中A—涡流扩散系数；B—分子扩散系数；C—传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。1.涡流扩散项－AA=2λdpdp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp↓，填充越均匀，A↓，H↓，柱效n↑2.分子扩散项—BB=2νDgν：弯曲因子，填充柱色谱，ν1Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）。由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散：扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差3.传质阻力项—C组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL，液相传质阻力大于气相传质阻力。即：C=（Cg+CL）传质阻力导致C↑，H↑，n↓分离变差。C与扩散系数、液膜厚度等有关4.载气流速与柱效-最佳流速载气流速高时，传质阻力项是影响柱效的主要因素由于流速对这两项完全相反的作用，以塔板高度H对载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。载气流速低时，分子扩散项成为影响柱效的主要因素H–u曲线与最佳流速5.速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配不能瞬间达到平衡等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。第三节色谱分离条件的选择一、分离度(Resolution,R)同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：2121112122()()1()2RRRRrRRttttttR用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R二、分离方程式)1(4)1)(1(422有效nkknR1212//kkKKR≥1.5作为两相邻组分完全分开的条件柱效柱选择性柱容量α是选择性因子（1）分离度与柱效分离度与柱效的平方根成正比，α一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间延长。（2）分离度与选择性增大α是提高分离度的最有效方法，增大α的最有效方法是选择合适的固定液。当α=1时,无论n有效多大，也不可能实现分离，所以有选择性是分离的前提。（2）分离度与分配比k〉10，对R影响不大；k1,分离度差；合适的范围是1k10讨论色谱分离中的四种典型情况①分离效果差，柱效低，选择性低;②完全分离，柱效高，峰窄，选择性低;③完全分离，选择性增加，柱效低，峰宽；④完全分离，柱效高，选择性好。R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间t,min第四节气相色谱法一、概念以气体（载气）作为流动相的一种色谱法。在此法中，载气不与被测物作用，只是用来载送试样。试样成分与固定相作用分离载气系统进样系统柱系统检测系统温控系统固定相气-固色谱（吸附剂）非极性的活性炭弱极性的氧化铝极性的分子筛氢键型硅胶高分子多孔微球担体:硅藻土型、非硅藻土气-液色谱固定液:极性、非极性、弱极性流动相（载气）：H2、N2、He气相色谱二、气相色谱仪1.载气系统：包括气源、净化干燥管和载气流速控制;2.进样系统：进样器及气化室；3.色谱柱：填充柱（填充固定相）或毛细管柱（内壁涂有固定液）4.检测器：以热导检测器或氢火焰检测器最为常见；5.记录系统：放大器、记录仪或数据处理仪；6.温度控制系统：柱室、气化室的温度控制。三、气相色谱检测器氢焰离子化检测器——含碳有机物质量型火焰光度检测器——含S、P化合物检测器热导检测器——通用型检测器浓度型电子捕获检测器——电负性有机化合物1色谱柱的选择：选择固定相和柱长（1）固定相选择——极性、最高使用温度（2）柱长：增加柱长，能增加塔板数n，使分离度提高，但分析时间延长，在保证分离度的前提下选择短柱。2、柱温的选择：在符合分离度要求的前提下，尽可能采用较低柱温。分离高沸点样品（300~400℃）：柱温比沸点低100～150℃。分离沸点＜300℃的样品：柱温比沸点低50~100℃。分离宽沸程样品：程序升温四、气相色谱实验条件的选择3、载气的选择：种类和流速载气线速度较低时，用氮气；较高时，用氦气或氢气。为缩短分析时间，载气流速通常高于最佳流速。4、其它条件的选择（1）气化室温度：比柱温高30-70（2）检测室温度：随检测器不同而不同，但比柱温高（3）进样量：保证待测组分出