色谱分离过程

第11章色谱分离过程chromatography一、概述定义：色谱是根据混合物中，溶质在互不混溶的两相之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进行分离的方法。典型的柱层析分离设备起源几个概念色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。色谱流程及主要部件操作术语：①洗脱剂——作为流动相的液体。②层析剂——分离技术中的固定相③展开——加入洗脱剂而使各组分分层的操作。④色谱图——展开后各组分的分布情况。⑤洗脱液——洗脱时从柱中流出的溶液。加样，洗脱剂冲洗各组分与固定相无作用力——与洗脱剂一起流动，得不到分离；各组分与固定相有一定作用力——移动速率低于流动相。各组分与固定相的作用力大小不同——移动速率不同，作用力大，移动慢，各组分得到分离。层析柱——径高比（10：1—1：100）、材质（玻璃、有机玻璃、PVC、不锈钢等）、耐压（0.05－10MPa）等实验室用的层析柱工业用的层析柱泵——恒速、压力（蠕动泵等）蠕动泵自动馏分收集仪（国产）自动馏分收集仪（进口）馏分收集仪检测仪1)通用型—示差折光、介电常数、电导等2)专用型—紫外、荧光、放射性检测器等记录仪、工作站—色谱参数的选择和设定、自动化操作、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、数据后处理、自动打印出一套完整的色谱分析数据……伯乐公司（BIO-RAD）柱层析系统发玛西亚公司（Pharmacia）柱层析系统国产柱层析系统二、色谱分离过程的基本原理1分离原理色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异。以吸附色谱为例见图示吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→差速迁移→分离分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出2固定相（色谱柱填料)硅胶衍生的固定相离子交换树脂大孔吸附树脂凝胶手性固定相3色谱柱及柱技术色谱柱的装填方法：高压均浆填充干法填充径向压缩法轴向压缩法环形压缩技术三、色谱分离过程和色谱图图1色谱过程图2色谱图1色谱图（chromatogram）试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图2常用术语：1.基线在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。2.色谱峰当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。3.峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peakheight)。用h表示。4.峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积(peakarea)，用A表示。四、色谱分离过程基础理论1保留值试样中各组分在色谱柱中停留时间值或将组分带出色谱柱所需流动相的体积值称为保留值。1)保留时间：从进样至被测组分出现浓度最大值时所需时间tR。2)保留体积：从进样至被测组分出现最大浓度时流动相通过的体积，VR。3)死时间：不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时所需的时间称为死时间(deadtime)，tM。4)死体积:不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大值时流动相通过的体积称为死体积(deadvolume)，VM。2分离度相临两组分间峰顶间距离除以此两峰底宽的平均值,衡量色谱分离条件优劣的参数22112WWttRRR峰宽和之半）保留值之差（峰顶间距2112)(2WWttRRR3柱效率塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则H=L/n式中n为理论塔板数。理论塔板数可根据色谱图上所测得的保留时间（tR）和峰宽（w）或半峰宽（wh/2）按下式计算：或2)(16WtnR22)(54.5hRWtn有效塔板数（neff）用有效塔板数（neff）来评价柱的效能比较符合实际。222/)'(16)'(54.5wtwtnRhReff五、色谱的分类1）、按两相所处的状态分类2）、按固定相的几何形式分类A柱色谱法B纸色谱法C薄层色谱法A.柱色谱法(columnchromatography)柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。B.纸色谱法（paperchromatography）纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。C.薄层色谱法(thin-layerchromatography,TLC)薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。3）、按分离原理分类按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：1.吸附色谱法2.分配色谱法3.离子交换色谱法4.尺寸排阻色谱法5.亲和色谱法1.吸附色谱法(adsorptionchromatography)利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。分离原理各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心,利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分离.a:吸附剂m:流动相Xm:流动相中的组分分子Xa:固定相中组分的分子Ym:流动相分子Ya:固定相中溶剂分子吸附过程是试样中组分分子与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程。固定相固定相是表面具有许多吸附中心的吸附剂，常用吸附剂硅胶表面的硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱使用一般硅胶，高效液相色谱常用球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。（1）对吸附剂的要求①有大的表面积和足够的吸附能力；②对不同的化学成分有不同的吸附力，能较好地把混合物分开；③与流动相、溶剂及样品中各成分不起化学反应；④在所用的溶剂及流动相中不溶解；⑤颗粒均匀，操作过程中不会碎裂。（2）吸附剂的类别①有机类淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纤维素等②无机类氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、硅藻土等流动相（1）要求①应使用较纯试剂，含杂质会影响洗脱能力②与样品或吸附剂不发生化学反应③能溶解样品中各成分，且各被分离组分有不同的K值④粘度小，易流动洗脱顺序流动相的洗脱能力主要由其极性决定，极性强的流动相分子占据极性中心的能力强，洗脱能力就强。流动相的选择要依据样品的极性、吸附剂的活性而定。吸附弱的组分先被洗脱，吸附强的组分后被洗脱。吸附的强弱与组分的性质(极性、取代基的类型和数目、构型）有关。一般规律是：①非极性化合物，吸附弱。②基本母核相同，分子中取代基的极性越强，或极性基团越多，分子极性越强(但要考虑其他因素的影响)，吸附能力越强。③分子中双键数越多，则吸附力越强。④能形成分子内氢键的化合物，其吸附能力降低。2.分配色谱法(partitionchromatography)将液体均匀地涂渍在惰性物质(载体)表面上作为固定相，利用被分离组分在固定相与流动相中的溶解度差别所造成的分配系数差别而被分离。分离机制利用组分在流动相和固定相间溶解度差别实现分离要求：固定相→机械吸附在惰性载体上的液体,常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等强极性溶剂载体→惰性物质，无吸附性性质稳定，不与固定相和流动相发生化学反应常用的有吸水硅胶、纤维素、多孔硅藻土等。流动相→必须与固定相不为互溶石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷及苯等。洗脱顺序正相色谱固定相极性大于流动相极性,主要分离极性样品.极性弱的组分先被洗脱，极性强的组分后被洗脱。反相色谱固定相极性小于流动相极性,主要分离非极性样品和中等极性样品.极性强的组分先出柱，极性弱的组分后出柱。3.离子交换色谱法要求：固定相→离子交换树脂流动相→水为溶剂的缓冲溶液被分离组分→离子型的有机物或无机物分离机制：依据被测组分与离子交换剂交换能力不同而实现分离固定相固定相是离子交换剂——常见的是离子交换树脂，是具有网状立体结构高分子的聚合物。如，苯乙烯和二乙烯苯聚合，其中二乙烯苯是交联剂。交联度(degreeofcrosslinking)——指交联剂在原料中所占总重量的百分比理论交换容量(exchangecapacity)——每克干树脂能交换离子的毫摩尔数粒度——指离子交换树脂颗粒的大小，一般以溶胀态所能通过的筛孔来表示。流动相——水、缓冲溶液、或加入少量的乙醇、四氢呋喃、乙腈等有机溶剂，提高选择性洗脱顺序交换能力强的离子组成的流动相有较强的洗脱能力。强离子交换树脂的交换容量不随流动相的pH变化，调节pH值的主要作用是控制弱电解质离解。4.尺寸排阻色谱法要求：固定相→多孔性凝胶流动相→水——凝胶过滤色谱流动相→有机溶剂——凝胶渗透色谱分离机制：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离固定相主要是多孔凝胶，主要性能参数是：平均孔径：凝胶孔径大小。排斥极限：不能渗透进入凝胶的任何孔隙的某分子量(KP=0)。分子量范围：排斥极限(KP=0)与全渗透点(KP=1)之间的分子量范围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。流动相要选对样品的溶解好，又能润湿凝胶。粘度要低的溶剂，否则，会限制分子扩散而影响分离效果。一般水溶性试样选水溶液，非水溶性试样选四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的原理，建立起来的色谱法称亲和色谱法。5、亲和色谱法亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。亲和色谱法的基本过程是：1.配基固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附剂后装柱。2.亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。3.解吸附。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。思考题：1色谱的定义和分离原理？2色谱图，基线，色谱峰，峰高，峰面积，保留值的概念？3按固定相的几何形式色谱可以分为那三类，各有什么特点？4按分离原理色谱可以分为那几类，各有什么特点？它们的分离机制各是什么？